We report a comprehensive proteogenomics analysis, including whole-genome sequencing, RNA sequencing, and proteomics and phosphoproteomics profiling, of 218 tumors across 7 histological types of childhood brain cancer: low-grade glioma (n = 93), ependymoma (32), high-grade glioma (25), medulloblastoma (22), ganglioglioma (18), craniopharyngioma (16), and atypical teratoid rhabdoid tumor (12). Proteomics data identify common biological themes that span histological boundaries, suggesting that treatments used for one histological type may be applied effectively to other tumors sharing similar proteomics features. Immune landscape characterization reveals diverse tumor microenvironments across and within diagnoses. Proteomics data further reveal functional effects of somatic mutations and copy number variations (CNVs) not evident in transcriptomics data. Kinase-substrate association and co-expression network analysis identify important biological mechanisms of tumorigenesis. This is the first large-scale proteogenomics analysis across traditional histological boundaries to uncover foundational pediatric brain tumor biology and inform rational treatment selection.

ABSTRACT CTCF is a key organizer of the 3D genome. Its specialized paralog, BORIS, heterodimerizes with CTCF but is expressed only in male germ cells and in cancer states. Unexpectedly, BORIS-null mice have only minimal germ cell defects. To understand the CTCF-BORIS relationship, mouse models with varied CTCF and BORIS levels were generated. Whereas Ctcf + / + Boris + / + , Ctcf + /- Boris + / + , and Ctcf + / + Boris -/- males are fertile, Ctcf + /- Boris -/- (Compound Mutant; CM) males are sterile. Testes with combined depletion of both CTCF and BORIS show reduced size, defective meiotic recombination, increased apoptosis, and malformed spermatozoa. Although CM germ cells exhibit only 25% of CTCF WT expression, chromatin binding of CTCF is preferentially lost from CTCF-BORIS heterodimeric sites. Furthermore, CM testes lose the expression of a large number of spermatogenesis genes and gain the expression of developmentally inappropriate genes that are “toxic” to fertility. Thus, a combined action of CTCF and BORIS is required to both repress pre-meiotic genes and activate post-meiotic genes for a complete spermatogenesis program.

Abstract BACKGROUND Medulloblastoma (MB) is one of the most common malignant childhood brain tumors. The sonic hedgehog (SHH) subgroup represents 30% of MBs and can arise from granule neuron progenitors (GNPs). SHH-MB is a diverse subgroup of tumors which often exhibit loss-of function mutations in PTCH1 or SUFU, activating mutations in the receptor SMO and amplification of the transcription factor GLI2. Of note, SHH-MBs harboring GLI2-amplification and associated with P53 mutations have extremely poor prognosis with a 5-year survival rate less than 30%. These tumors are non-responsive to SMO inhibitors, which are the only targeted treatment currently available for SHH-MB. Therefore, the development of novel effective therapies for this disease is urgent. Although GLI2 amplification is detected in SHH-MBs, it is not yet known if GLI2 can drive oncogenic activity in this disease. METHOD To elucidate the mechanisms underlying tumorigenesis, our group has developed a novel transgenic model of GLI2-driven MB by expressing a constitutively active form of GLI2 (GLI2A) in Atoh1+ cells in the developing mouse cerebellum to form tumors. To accomplish this, we crossed R26;Gli2A mice with Atoh1-Cre. RESULTS The resulting tumors faithfully recapitulate human GLI2-amplified MB at the cellular and molecular levels. Inactivation of GLI2A resulted in tumor regression, indicating that GLI2 is not only critical for tumorigenesis, but also required for tumor maintenance, suggesting that targeting GLI2 itself or its downstream targets may be effective to inhibit growth of GLI2-driven MB. Interestingly, activation of GLI2A expression in the neonatal cerebellum was not sufficient to drive tumorigenesis, indicating that GLI2-driven MB arises from more primitive cells in the developing cerebellum. CONCLUSION Taken together, our studies demonstrate for the first time the role of GLI2 as an oncogenic driver of MB and introduce a novel mouse model which can be used to develop targeted therapies for this disease.

ABSTRACT Neoantigen discovery in pediatric brain tumors is hampered by their low mutational burden and scant tissue availability. We developed a low-input proteogenomic approach combining tumor DNA/RNA sequencing and mass spectrometry proteomics to identify tumor-restricted (neoantigen) peptides arising from multiple genomic aberrations to generate a highly target-specific, autologous, personalized T cell immunotherapy. Our data indicate that novel splice junctions are the primary source of neoantigens in medulloblastoma, a common pediatric brain tumor. Proteogenomically identified tumor-specific peptides are immunogenic and generate MHC II-based T cell responses. Moreover, polyclonal and polyfunctional T cells specific for tumor-specific peptides effectively eliminated tumor cells in vitro. Targeting novel tumor-specific antigens obviates the issue of central immune tolerance while potentially providing a safety margin favoring combination with other immune-activating therapies. These findings demonstrate the proteogenomic discovery of immunogenic tumor-specific peptides and lay the groundwork for personalized targeted T cell therapies for children with brain tumors.

5034 Background: Serum tumor markers (STM) (AFP, hCG) are currently utilized in the management of patients (pts) with testicular cancer. However, in a substantial proportion of pts STM can be normal or falsely elevated. We evaluated the clinical utility of longitudinal ctDNA monitoring as a prognostic marker in pts with testicular cancer. Methods: Longitudinal analysis was performed on a multi-institutional cohort of pts with stages I-III testicular cancer using a clinically validated, personalized, tumor-informed 16-plex PCR ctDNA assay (Signatera, Natera Inc.). ctDNA was evaluated pre-orchiectomy, during the MRD (1-12 weeks post-orchiectomy) and surveillance windows (>12 weeks post-orchiectomy, after retroperitoneal lymph node dissection [RPLND], and/or chemotherapy). The correlation between ctDNA status and event-free survival (EFS) was assessed. EFS is described as the interval from orchiectomy to the date of radiological recurrence or any evidence of residual/persistent disease post-completion of chemotherapy or RPLND. This analysis includes 28 pts from Icahn School of Medicine, 20 pts from Indiana University, and 7 pts from City of Hope. Results: Plasma samples (n=197) were collected from 55 pts - %stage I/II/III: 42/22/36; %seminoma/non-seminoma: 31/69. The median age was 34 years (range: 16-67), and the median follow-up was 11 months (range: 2-76). Disease management post-orchiectomy included surveillance in 27% (15/55), RPLND in 11% (6/55), chemotherapy in 40% (22/55), and chemotherapy+RPLND in 22% (12/55) of the pts. Pre-orchiectomy ctDNA was detectable in 14/15 pts - 91.6% (11/12) of pts with stage I, and 100% (3/3) of pts with stage II/III disease. ctDNA evaluation pre-RPLND (N=7; 1 seminoma, 6 non-seminoma) revealed ctDNA-positivity in 6 pts. Six pts had ctDNA testing performed pre- and post-completion of chemotherapy for stage II/III disease; ctDNA exhibited a median MTM/mL reduction of 96.5% (range: 75.6–100) post-treatment completion. Seventeen pts had ctDNA testing post-RPLND or chemotherapy; 0/9 pts with undetectable ctDNA relapsed while 4/8 pts with detectable ctDNA experienced clinical recurrence at the most recent evaluation with follow-up ongoing. During the MRD (N=27) and surveillance (N=36) windows, pts with detectable vs. undetectable ctDNA showed a significantly inferior EFS (MRD: HR= 5.27, 95% CI: 1.22-22.71; p=0.026. Surveillance: HR= 10.8, 95% CI: 2.53-46.01; p=0.001). During the surveillance window, elevated STM vs. normal STM was not associated significantly with worse EFS (HR= 2.01, 95%Cl: 0.71-5.72; p=0.191). Conclusions: Tumor-informed ctDNA analysis shows promise for MRD detection in pts with testicular cancer. With further study, ctDNA monitoring may have utility in clinical decision-making. Larger prospective trials are planned for validation of clinical utility.