ABSTRACT Ribosomal RNA (rRNA) is the major RNA constituent of cells, therefore most RNA sequencing (RNA-Seq) experiments involve removal of rRNA. This process, called RNA enrichment, is done primarily to reduce cost: without rRNA removal, deeper sequencing would need to be performed to balance the sequencing reads wasted on rRNA. The ideal RNA enrichment method would remove all rRNA without affecting other RNA in the sample. We have tested the performance of three RNA enrichment methods on RNA isolated from Cryptococcus neoformans , a fungal pathogen of humans. We show that the RNase H depletion method unambiguously outperforms the commonly used Poly(A) isolation method: the RNase H method more efficiently depletes rRNA while more accurately recapitulating the expression levels of other RNA observed in an unenriched “gold standard”. The RNase H depletion method is also superior to the Ribo-Zero depletion method as measured by rRNA depletion efficiency and recapitulation of protein-coding gene expression levels, while the Ribo-Zero depletion method performs moderately better in preserving non-coding RNA (ncRNA). Finally, we have leveraged this dataset to identify novel long non-coding RNA (lncRNA) genes and to accurately map the C. neoformans mitochondrial rRNA genes. ARTICLE SUMMARY We compare the efficacy of three different RNA enrichment methods for RNA-Seq in Cryptococcus neoformans : RNase H depletion, Ribo-Zero depletion, and Poly(A) isolation. We show that the RNase H depletion method, which is evaluated in C. neoformans samples for the first time here, is highly efficient and specific in removing rRNA. Additionally, using data generated through these analyses, we identify novel long non-coding RNA genes in C. neoformans . We conclude that RNase H depletion is an effective and reliable method for preparation of C. neoformans RNA-Seq libraries.

Limited antifungal diversity and availability are growing problems for the treatment of fungal infections in the face of increasing drug resistance. The echinocandins, one of the newest classes of antifungal drugs, inhibit production of a crucial cell wall component. However, these compounds do not effectively inhibit the growth of the opportunistic fungal pathogen Cryptococcus neoformans, despite potent inhibition of the target enzyme. We therefore performed a forward genetic screen to identify cellular processes that mediate the relative tolerance of this organism to the echinocandin drug, caspofungin. Through these studies, we identified 14 genetic mutants that enhance caspofungin antifungal activity. Rather than directly affecting caspofungin antifungal activity, these mutations seem to prevent the activation of various stress-induced compensatory cellular processes. For example, the pfa4Δ mutant has defects in the palmitoylation and localization of many of its target proteins, including the Ras GTPase and the Chs3 chitin synthase which are both required for caspofungin tolerance. Similarly, we have confirmed the link between caspofungin treatment and calcineurin signaling in this organism, but we suggest a deeper mechanism in which caspofungin tolerance is mediated by multiple pathways downstream of calcineurin function. Additionally, a partial loss-of-function mutant of a COP9 signalosome component results in a highly caspofungin-susceptible strain of C. neoformans. In summary, we describe here several pathways in C. neoformans that contribute to the complex caspofungin tolerance phenotype in this organism.

ABSTRACT Cellular responses to external stress allow microorganisms to adapt to a vast array of environmental conditions, including infection sites. The molecular mechanisms behind these responses are studied to gain insight into microbial pathogenesis, which could lead to new antimicrobial therapies. Here, we explore a role for arrestin protein-mediated ubiquitination in stress response and pathogenesis in the pathogenic fungus Cryptococcus neoformans . In a previous study, we identified four arrestin-like proteins in C. neoformans and found that one of these is required for efficient membrane synthesis, likely by directing interaction between fatty acid synthases and the Rsp5 E3 ubiquitin ligase. Here, we further explore Cn Rsp5 function and determine that this single Ub ligase is absolutely required for pathogenesis and survival in the presence of cellular stress. Additionally, we show that a second arrestin-like protein, Ali2, similarly facilitates interaction between Rsp5 and some of its protein targets. Of the four postulated C. neoformans arrestin-like proteins, Ali2 appears to contribute the most to C. neoformans pathogenesis, likely by directing Rsp5 to pathogenesis-related ubiquitination targets. A proteomics-based differential ubiquitination screen revealed that several known cell surface proteins are ubiquitinated by Rsp5 and a subset also requires Ali2 for their ubiquitination. Rsp5-mediated ubiquitination alters the stability and the localization of these proteins. A loss of Rsp5-mediated ubiquitination results in cell wall defects that increase susceptibility to external stresses. These findings support a model in which arrestin-like proteins guide Rsp5 to ubiquitinate specific target proteins, some of which are required for survival during stress. IMPORTANCE Microbial proteins involved in human infectious diseases often need to be modified by specific chemical additions to be fully functional. Here, we explore the role of a particular protein modification, ubiquitination, in infections due to the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans . We identified a complex of proteins responsible for adding ubiquitin groups to fungal proteins, and this complex is required for virulence. These proteins are fungal specific and might be targets for novel anti-infection therapy.

Arrestins, a structurally specialized and functionally diverse group of proteins, are central regulators of adaptive cellular responses in eukaryotes. Previous studies on fungal arrestins have demonstrated their capacity to modulate diverse cellular processes through their adaptor functions, facilitating the localization and function of other proteins. However, the mechanisms by which arrestin-regulated processes are involved in fungal virulence remain unexplored. We have identified a small family of four arrestins - Ali1, Ali2, Ali3, and Ali4 - in the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans . Using complementary microscopy, proteomic, and reverse genetic techniques, we have defined a role for Ali1 as a novel contributor to cytokinesis, a fundamental cell cycle-associated process. We observed that Ali1 strongly interacts with proteins involved in lipid synthesis, and that ali1 Δ mutant phenotypes are rescued by supplementation with lipid precursors that are used to build cellular membranes. From these data, we hypothesize that Ali1 contributes to cytokinesis by serving as an adaptor protein, facilitating the localization of enzymes that modify the plasma membrane during cell division, specifically the fatty acid synthases, Fas1 and Fas2. Finally, we assessed the contributions of the C. neoformans arrestin family to virulence, to better understand the mechanisms by which arrestin-regulated adaptive cellular responses influence fungal infection. We observed that the C. neoformans arrestin family contributes to virulence, and that the individual arrestin proteins likely fulfill distinct functions that are important for disease progression.

Abstract During mammalian colonization and infection, microorganisms must be able to rapidly sense and adapt to changing environmental conditions including alterations in extracellular pH. The fungus-specific Rim/Pal signaling pathway is one process that supports microbial adaptation to alkaline pH. This cascading series of interacting proteins terminates in the proteolytic activation of the highly conserved Rim101/PacC protein, a transcription factor that mediates microbial responses that favor survival in neutral/alkaline pH growth conditions, including many mammalian tissues. We identified the putative Rim pathway proteins Rim101 and Rra1 in the human skin colonizing fungus Malassezia sympodialis . Gene deletion by transconjugation and homologous recombination revealed that Rim101 and Rra1 are required for M. sympodialis growth at higher pH. Additionally, comparative transcriptional analysis of the mutant strains compared to wild-type suggested mechanisms for fungal adaptation to alkaline conditions. These pH-sensing signaling proteins are required for optimal growth in a murine model of atopic dermatitis, a pathological condition associated with increased skin pH. Together these data elucidate both conserved and phylum-specific features of microbial adaptation to extracellular stresses. Importance The ability to adapt to host pH has been previously associated with microbial virulence in several pathogenic fungal species. Here we demonstrate that a fungal-specific alkaline response pathway is conserved in the human skin commensal fungus Malassezia sympodialis ( Ms ). This pathway is characterized by the pH-dependent activation of the Rim101/PacC transcription factor that controls cell surface adaptations to changing environmental conditions. By disrupting genes encoding two predicted components of this pathway, we demonstrated that the Rim/Pal pathway is conserved in this fungal species as a facilitator of alkaline pH growth. Moreover, targeted gene mutation and comparative transcriptional analysis supports the role of the Ms Rra1 protein as a cell surface pH sensor conserved within the basidiomycete fungi, a group including plant and human pathogens. Using an animal model of atopic dermatitis, we demonstrate the importance of Ms Rim/Pal signaling in this common inflammatory condition characterized by increased skin pH.

The ability for cells to maintain homeostasis in the presence of extracellular stress is essential for their survival. Stress adaptations are especially important for microbial pathogens to respond to rapidly changing conditions, such as those encountered during the transition from the environment to the infected host. Many fungal pathogens have acquired the ability to quickly adapt to changes in extracellular pH to promote their survival in the various micro-environments encountered during a host infection. For example, the fungal-specific Rim/Pal alkaline response pathway has been well characterized in many fungal pathogens, including Cryptococcus neoformans . However, alternative mechanisms for sensing and responding to host pH have yet to be extensively studied. Recent observations from a genetic screen suggest that the C. neoformans sterol homeostasis pathway is required for growth at elevated pH. This work explores interactions among mechanisms of membrane homeostasis, alkaline pH tolerance, and Rim pathway activation. We find that the sterol homeostasis pathway is necessary for growth in an alkaline environment, and that an elevated pH is sufficient to induce Sre1 activation. This pH-mediated activation of the Sre1 transcription factor is linked to the biosynthesis of ergosterol, but is not dependent on Rim pathway signaling, suggesting that these two pathways are responding to alkaline pH independently. Furthermore, we discover that C. neoformans is more susceptible to membrane-targeting antifungals in alkaline conditions highlighting the impact of micro-environmental pH on the treatment of invasive fungal infections. Together, these findings further connect membrane integrity and composition with the fungal pH response and pathogenesis.

ABSTRACT Many successful pathogens cause latent infections, remaining dormant within the host for years but retaining the ability to reactivate to cause symptomatic disease. The human opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans is a ubiquitous yeast that establishes latent pulmonary infections in immunocompetent individuals upon fungal inhalation from the environment. These latent infections are frequently characterized by granulomas, or foci of chronic inflammation, that contain dormant cryptococcal cells. Immunosuppression causes these granulomas to break down and release viable fungal cells that proliferate, disseminate, and eventually cause lethal cryptococcosis. This course of C. neoformans dormancy and reactivation is understudied due to limited models, as chronic pulmonary granulomas do not typically form in most mouse models of cryptococcal infection. Here, we report that a previously characterized Cryptococcus -specific gene which is required for host-induced cell wall remodeling, MAR1, inhibits murine granuloma formation. Specifically, the mar1 Δ loss-of-function mutant strain induces mature pulmonary granulomas at sites of infection dormancy in mice. Our data suggest that the combination of reduced fungal burden and increased immunogenicity of the mar1 Δ mutant strain stimulates a host immune response that contains viable fungi within granulomas. Furthermore, we find that the mar1 Δ mutant strain has slow growth and hypoxia resistance phenotypes, which may enable fungal persistence within pulmonary granulomas. Together with the conventional primary murine infection model, latent murine infection models will advance our understanding of cryptococcal disease progression and define fungal features important for persistence in the human host.