Abstract Neutrophil migration and activation are essential for defense against pathogens. However, this process may also lead to collateral tissue injury. We used microRNA overexpression as a platform and discovered protein-coding genes that regulate neutrophil migration. Here we show that miR-99 decreased the chemotaxis of zebrafish neutrophils and human neutrophil-like cells. In zebrafish neutrophils, miR-99 directly targets the transcriptional factor RAR-related orphan receptor alpha (roraa) . Inhibiting RORα, but not the closely related RORγ, reduced chemotaxis of zebrafish and primary human neutrophils without causing cell death, and increased susceptibility of zebrafish to bacterial infection. Expressing a dominant-negative form of Rorα or disrupting the roraa locus specifically in zebrafish neutrophils reduced cell migration. At the transcriptional level, RORα regulates transmembrane signaling receptor activity and protein phosphorylation pathways. Our results, therefore, reveal previously unknown functions of miR- 99 and RORα in regulating neutrophil migration and anti-microbial defense.

The ubiquitin regulatory X (UBX) domain-containing proteins (UBXNs) are putative adaptors for ubiquitin ligases and valosin-containing protein; however, their in vivo physiological functions remain poorly characterised. We recently showed that UBXN3B is essential for activating innate immunity to DNA viruses and controlling DNA/RNA virus infection. Herein, we investigate its role in adaptive immunity.

Monocytes are critical in controlling tissue infections and inflammation. Monocyte dysfunction contributes to the inflammatory pathogenesis of cystic fibrosis (CF) caused by CF transmembrane conductance regulator (CFTR) mutations, making CF a clinically relevant disease model for studying the contribution of monocytes to inflammation. Although CF monocytes exhibited adhesion defects, the precise mechanism is unclear. Herein, superresolution microscopy showed that an integrin clustering but not an integrin activation defect determines the adhesion defect in CFTR-deficient monocytes, challenging the existing paradigm emphasizing an integrin activation defect in CF patient monocytes. We further found that the clustering defect is accompanied by defects in CORO1A membrane recruitment, actin cortex formation, and CORO1A engagement with integrins. Complementing canonical studies of leukocyte adhesion focusing on integrin activation, we highlight the importance of integrin clustering in cell adhesion and report that integrin clustering and activation are distinctly regulated, warranting further investigation for selective targeting in therapeutic strategy design involving leukocyte-dependent inflammation.

1. Kindlin-3 but not talin-1 contributes to integrin inside-out signaling induced β2 integrin clustering. 2. The Pleckstrin homology domain of kindlin-3 was critical for its mediated β2 integrin clustering. Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood, and their recruitment is essential for innate immunity and inflammatory responses. The initial and critical step of neutrophil recruitment is their adhesion to vascular endothelium, which depends on G protein-coupled receptor (GPCR) triggered integrin inside-out signaling that induces β2 integrin activation and clustering on neutrophils. Kindlin-3 and talin-1 are essential regulators for the inside-out signaling induced β2 integrin activation. However, their contribution in the inside-out signaling induced β2 integrin clustering is unclear because conventional assays on integrin clustering are usually performed on adhered cells, where integrin–ligand binding concomitantly induces integrin outside-in signaling. We used flow cytometry and quantitative super-resolution stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) to quantify β2 integrin activation and clustering, respectively, in kindlin-3 and talin-1 knockout leukocytes. We also tested whether wildtype or Pleckstrin homology (PH) domain deleted kindlin-3 can rescue the kindlin-3 knockout phenotypes. GPCR-triggered inside-out signaling alone can induce β2 integrin clustering. As expected, both kindlin-3 and talin-1 knockout decreases integrin activation. Interestingly, only kindlin-3 but not talin-1 contributes to integrin clustering in the scenario of inside-out-signaling, wherein a critical role of the PH domain of kindlin-3 was highlighted. Since talin was known to facilitate integrin clustering in outside-in-signaling-involved cells, our finding provides a paradigm shift by suggesting that the molecular mechanisms of integrin clustering upon inside-out signaling and outside-in signaling are different. Our data also contradict the conventional assumption that integrin activation and clustering are tightly inter-connected by showing separated regulation of the two during inside-out signaling. Our study provides a new mechanism that shows kindlin-3 regulates β2 integrin clustering and suggests that integrin clustering should be assessed independently, aside from integrin activation, when studying leukocyte adhesion in inflammatory diseases.