Previously, identification of promoters regulated by mammalian transcription factors has relied upon overexpression studies. Here we present the identification of a large set of promoters that are bound by E2F in physiological conditions. Probing a human CpG microarray with chromatin immunoprecipitated using an antibody to E2F4, we have identified 68 unique target loci; 15% are bidirectional promoters and 25% recruit E2F via a mechanism distinct from the defined consensus site. Interestingly, although E2F has been shown previously to regulate genes involved in cell cycle progression, many of the new E2F target genes encode proteins involved in DNA repair or recombination. We suggest that human CpG microarrays, in combination with chromatin immunoprecipitation, will allow rapid identification of target promoters for many mammalian transcription factors.

PURPOSE The new CAP guideline published in August 2022 recommends using immunohistochemistry (IHC) to test for mismatch repair defects in gastroesophageal (GE), small bowel (SB), or endometrial carcinoma (EC) cancers over next-generation sequencing assessment of microsatellite instability (NGS-MSI) for immune checkpoint inhibitor (ICI) therapy eligibility and states there is a preference to use IHC over NGS-MSI in colorectal carcinoma (CRC). METHODS We assessed the concordance of NGS-MSI and IHC-MMR from a very large cohort across the spectrum of solid tumors. RESULTS Of the over 190,000 samples with both NGS-MSI and IHC-MMR about 1,160 were initially flagged as discordant. Of those samples initially flagged as discordant, 50.9% remained discordant after being reviewed by an additional pathologist. This resulted in a final discordance rate of 0.31% (590/191,767). Among CRC, GE, SB and EC, 55.4% of mismatch repair proficient/MSI high (MMRp/MSI-H) tumors had at least one somatic pathogenic mutation in an MMR gene or POLE . Mismatch repair deficient/microsatellite stable (MMRd/MSS) tumors had a significantly lower rate of high tumor mutational burden than MMRp/MSI-H tumors. Across all solid tumors, MMRd/MSI-H tumors had significantly longer overall survival (OS; hazard ratio [HR], 1.47, P < .001) and post-ICI survival (HR, 1.82, P < .001) as compared with MMRp/MSS tumors. The OS for the MMRd/MSS group was slightly worse compared to the MMRp/MSI-H tumors, but this difference was not statistically significant (HR, 0.73, P = .058), with a similar pattern when looking at post-ICI survival (HR, 0.43, P = .155). CONCLUSION This study demonstrates that NGS-MSI is noninferior to IHC-MMR and can identify MSI-H tumors that IHC-MMR is unable to detect and conversely IHC-MMR can identify MMRd tumors that NGS-MSI misses.

Abstract The rarity of malignant Hodgkin and Reed Sternberg (HRS) cells within a classic Hodgkin lymphoma (cHL) biopsy limits the ability to study the genomics of cHL. To circumvent this, our group has previously optimized fluorescence-activated cell sorting to purify HRS cells. Here we leveraged this method to report the first whole genome sequencing landscape of HRS cells and reconstruct the chronology and likely etiology of pathogenic events prior to the clinical diagnosis of cHL. We identified alterations in driver genes not previously described in cHL, a high activity of the APOBEC mutational signature, and the presence complex structural variants including chromothripsis. We found that the high ploidy observed in cHL is often acquired through multiple, independent large chromosomal gain events including whole genome duplication. The first of these likely occurs several years prior to the diagnosis of cHL, and the last gains typically occur very close to the time of diagnosis. Evolutionary timing analyses revealed that driver mutations in B2M, BCL7A, GNA13 , and PTPN1 , and the onset of AID driven mutagenesis usually preceded large chromosomal gains. The study provides the first temporal reconstruction of cHL pathogenesis and suggests a relatively long time course between the first pathogenic event and the clinical diagnosis.

e23531 Background: Dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) is a locally aggressive skin and subcutaneous fibroblastic neoplasm, characterized by COL1A1:: PDGFB fusions and, less frequently, PDGFD fusions. Approximately 10-15% of DFSP cases progress to distant metastases, yet the genetic mechanisms behind this transformation to fibrosarcomatous DFSP (FS-DFSP) or metastatic development remain unclear. Reports of DFSP in deeper tissues suggest a broader occurrence than previously recognized. We hypothesize that conventional histopathology may not adequately identify certain DFSP variants, especially those in deep tissues, potentially missing critical opportunities for targeted therapy with FDA-approved tyrosine kinase inhibitors. Methods: We searched Caris’s database to identify solid tumors with PDGFB or PDGFD fusions, markers of DFSP or FS-DFSP. We reviewed histologic features and clinical information, along with exome sequencing and copy number amplifications. Significance was tested using Mann Whitney U and Fisher’s exact tests as appropriate. Results: We identified 59 cases with PDGFB or PDGFD fusions: 55 COL1A1:: PDGFB, 3 EMILIN2:: PDGFD, and 1 COL1A2:: PDGFB cases. Of these, 51 were primary specimens and 8 metastatic. The patients included 31 males and 28 females, with a median age of 49 years (range: 14-93). Primary tumors occurred mainly in the skin/subcutis or deep soft tissues (35 trunk, 9 head and neck, 7 lower extremity, 2 upper extremity), but 6 were found in visceral organs (4 uterus, 1 cervix, 1 lung). Histologically, 20 cases were conventional DFSP and 32 were FS-DFSP. Notably, 21 tumors (36%) had been initially misclassified; most of which had metastatic presentation, unusual histology, or atypical location. Tumor sequencing revealed a higher incidence of genetic changes in addition to the PDGFB/ PDGFD fusions: concurrent mutations were detected in 66% of FS-DFSP cases versus 25% of DFSP cases (p = 0.009). Moreover, tumor mutational burden was significantly higher in FS-DFSP than DFSP (p = 0.006). The most prevalent mutations were in the TERT promoter and NF1, found exclusively in FS-DFSP cases. Conclusions: Conventional histology commonly fails to recognize FS-DFSP, leading to missed opportunities for targeted therapy. This highlights the essential role of next-generation sequencing in achieving greater diagnostic accuracy for DFSP and its fibrosarcomatous variant. While no single gene mutation consistently differentiates DFSP from FS-DFSP, the occurrence of additional genetic alterations is notably more common in FS-DFSP cases.

5015 Background: Neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is a relatively androgen receptor (AR)-independent and aggressive variant of PC that can arise from adenocarcinoma with varied degrees of adenocarcinoma and high-grade neuroendocrine histologic features seen during its progression. This study evaluated the clinical and molecular features of histologic subtypes of prostate tumors (adenocarcinoma, NEPC, mixed adeno-NE) based on previously validated AR signaling and NEPC transcriptomic signatures of PC. Methods: Whole exome (WES) and whole transcriptome sequencing (WTS) were performed on PC tumors. Molecular subsets were defined by AR signaling signature [AR score positive (+) vs negative (-)] and NEPC gene signature [NE score positive (+) vs negative (-)]. The prevalence of key molecular alterations (RB1, TP53, PTEN, AR, FANC, SLFN11 expression) were investigated. Genes encoding cell surface antigens with potential therapeutic implications were described across signature groups. Overall survival (OS) was obtained from claims data and analyzed with Kaplan-Meier estimator. Results: A total of 4,476 prostate tumors were analyzed in this study including: 3,623 prostate adenocarcinoma, 56 NEPC, and 25 tumors with mixed adeno-NE. Tissue from 2,641 (67%) tumors were collected from prostate and 1,326 (33%) were metastatic tumors [lymph node (14%), bone (9%), liver (7%), lung (2%), CNS (2%)]. The four AR/NEPC signature-defined subtypes were AR+/NE+ (N=649, 14%), AR+/NE- (N=1614, 36%), AR-/NE+ (N=875, 20%), and AR-/NE- (N=1358, 30%). AR+/NE- was most common in prostate (39%), LN (42%) and lung metastasis (35%); AR-/NE+ was most common in bone (34%) and liver metastasis (43%); AR-/NE- was most common in CNS metastasis. The most common gene alterations in each molecular subtype are defined in Table. AR-/NE+ tumors had the lowest mRNA expression of FOLH1(PSMA), STEAP1, TACSTD2 (Trop-2), CD276 (B7-H3), and PSCA among the four groups. DLL3 expression was higher among NE+ subtypes. FOLH1 and PSCA expression were higher among NE- subtypes. The median OS (months) was longer in NE- than NE+ subtypes [AR+/NE- (78.3), AR-/NE- (78.7) vs AR+/NE+ (70.7), AR-/NE+ (69.1)]. In the platinum-treated subgroup (N=146), the median OS was numerically longer among tumors with SLFN11 overexpression (17.6 vs 12.0) although this was not statistically significant (p-value: 0.99). Conclusions: Molecularly distinct subtypes of PC can be further characterized by AR signaling signature, NEPC gene expression signature, and co-occurring molecular alterations. The phase II biomarker-driven PREDICT trial will integrate the above signatures/molecular alterations to allocate treatment regimens in metastatic castration-resistant PC. [Table: see text]

11544 Background: The mTOR pathway is a central signaling circuit that contributes to cancer cell proliferation, angiogenesis, metabolism, and other pivotal processes. The phase III SUCCEED trial showed marginal benefit of mTOR inhibition (mTORi) in chemo-responsive sarcomas, despite promising foundational phase II data. Since these trials did not account for mTOR-related physiology, we sought to identify sarcoma subgroups that display mTORC1 activated/activation phenotypes (mTORC1-act) that might derive more benefit from mTORi. Methods: DNA (592-gene or whole exome; N=7028) and RNA (whole transcriptome; N=3757) sequencing was performed from sarcoma patient samples, representing 49 histologic subtypes, submitted to Caris Life Sciences (Phoenix, AZ). A transcriptomic signature associated with up-regulation of mTORC1 complex activity (HALLMARK_MTORC1_SIGNALING, mSigDB) was analyzed by single-sample Gene Set Enrichment Analysis (ssGSEA). Real-world overall survival (OS) was obtained from insurance claims data and calculated from date of biopsy to last contact, with hazard ratio calculated using Cox proportional hazards model (p-values calculated by log-rank test). Results: Among the most mTORC1-act subtypes were PEComa (n=49, median ssGSEA score=0.114) and osteosarcoma (n=163, median score=0.084). Novel findings included high degrees of mTORC1-act in UPS (n=225, median score=0.132), IMT (n=36, median score=0.167), and epithelioid sarcoma (n=26, median score=0.155). Histologic subtype was a strong predictor of mTORC1-act (p<0.00001); other predictors were alterations in TSC2 (p<0.0001), TSC1 (p=0.0019), PTEN (p=0.0126), and PIK3R1 (p=0.0223). In PEComa, TSC2 alterations were associated with mTORC1-act (p=0.036), but TSC1 alterations were not (p=0.63). In a pan-sarcoma population, high ssGSEA mTORC1-act scores were associated with lower median OS of 15.4 months (m) compared to intermediate (24.2 m) and low (36.8 m) mTORC1-act scores (p<0.000001). Similar findings were observed for LMS (16.2 v 30.6 v 45.9 m, p<0.0001) and LPS (11.2 v 30.1 v 46.8 m, p<0.0001), but not all subtypes. Conclusions: The high levels of mTORC1-act in PEComa and osteosarcoma are consistent with prior reports. Increased mTORC1-act among TSC2-mutant, but not TSC1-mutant, PEComa aligns with lower responses to mTORi observed in non- TSC2-mutant patients in the AMPECT trial. Together, these findings support the use of ssGSEA to identify histologic subtypes (UPS, IMT, epithelioid) and genetic factors ( TSC2 variants > others) associated with increased mTORC1 activity that may predict for better responses to mTORi, and they suggest a clinical trial to further pursue this pathway in sarcomas. These data provide additional valuable prognostic information for patients with a wide range of sarcoma subtypes.

e18008 Background: Sinonasal tumors (SNT) are rare tumors and make up less than 3% of all head and neck malignancies. The majority of SNTs have squamous cell histology and less common histologies remain understudied. We present a comprehensive analysis of genomic and immune profiles of rare SNTs that can help identify avenues for prognostic biomarkers and future targeted treatments. Methods: Non-squamous SNT samples (n =124) were profiled through Next Generation Sequencing (NGS) of DNA (592-genes; NextSeq or WES; NovaSeq) and RNA (WTS; NovaSeq) at Caris Life Sciences (Phoenix, AZ). Centralized pathology review was carried out to confirm histological subtypes. PD-L1 expression was tested by IHC (22c3, positive (+) >=1%; SP142, positive (2+)/ >=5%). Deficient mismatch repair/microsatellite instability (dMMR/MSI-H) was accessed by IHC/NGS. Immune cell fraction of the tumor microenvironment (TME) was estimated by quanTIseq, and gene expression profiles (transcript per million, TPM) were analyzed for transcriptional signatures predictive of response to immunotherapy. Mann-Whitney U and ChiSquare/Fisher-Exact tests were applied where appropriate, with p-values adjusted for multiple comparisons. Results: Non-squamous SNT samples included 35.5% (n = 44) adenoid cystic (ACC), 19.4% (n = 24) adenocarcinoma (AD), 10.5% (n = 13) undifferentiated carcinomas (SNUC), and 34.6% (n = 43) Esthesio/Olfactory Neuroblastomas (ENB). Notably, molecular features associated with each histological subtype are reported in the table. Furthermore, analysis of the inferred immune infiltrates showed that ENB had significantly higher fractions of NK cells (ACC: 5.6% vs AD: 4.6% vs SNUC: 4.4% vs ENB:10.5%, p <0.00001), CD8 T cells (0.1% vs 0.88% vs 0.22% vs 1%, p < 0.0001), CD4 T cells (0.4% vs 1.9% vs 0.03% vs 3.6%, p < 0.00001) and dendritic cells (4.5% vs 3.4% vs 2.6% vs 7.3%, p<0.00001) compared to the other sinonasal tumors. M1 macrophage (ACC: 2.6% vs AD: 1.9% vs SNUC: 1.1% vs ENB: 1.1%, p = 0.047) and Treg fractions (ACC: 2.0% vs AD: 1.6% vs SNUC: 1.2% vs ENB: 0.6%, p<0.00001) were significantly higher in ACC. There was also significantly increased expression of immune checkpoint genes in ENB compared to AD ( PD-1: 0.8 vs 0.5 TPM, p = 0.022) and in ENB compared to ACC ( HAVCR2: 3.4 vs 2.9 TPM, p = 0.047). Conclusions: To our knowledge, this is the largest study characterizing the genomic and immune alterations in non-squamous SNTs. Our findings offer potential for future targeted and immune therapeutic applications in these rare diseases. [Table: see text]

The discovery of gene fusions involving Neuregulin-1 ( NRG1 ) within solid tumors has important therapeutic implications, as they are being actively explored as targets for emerging ERBB/ERBB2/ERBB3-directed anti-cancer agents. NRG1 fusions are very uncommon across all tumor types and are infrequently documented in the medical literature. We report a female patient presenting with widespread peritoneal carcinomatosis diagnosed as high grade serous fallopian tube carcinoma, which harbored a previously undescribed MYH10 :: NRG1 fusion. Moreover, we queried the whole transcriptome sequencing results of neoplasms analyzed by a commercial laboratory (Caris Life Sciences) to determine the overall incidence of NRG1 fusions in carcinomas of the ovary, fallopian tube, and peritoneum (0.18%). Twenty-five additional tumors were found to demonstrate NRG1 fusions, including 20 new genes partners that had not been previously identified in gynecologic carcinomas. Overall, NRG1 fusion events are rare in ovarian, fallopian tube, and primary peritoneal carcinomas, but they may carry diagnostic significance in the context of borderline/low grade serous tumors, which demonstrated exclusively CLU::NRG1 fusions, and could have important predictive implications for response to ERBB/ERBB2/ERBB3-directed therapies.

5561 Background: Targeted therapy in folate receptor alpha (FOLR1)-positive high grade serous ovarian carcinoma (HG) is now a mainstay for platinum-resistant disease, though the rate of FOLR1-positivity in low grade serous ovarian carcinoma (LG) is unknown. We compared the genomic and transcriptomic landscapes in FOLR1-positive/negative LG in comparison to its HG counterpart. Methods: LG (N = 281) and HG (N = 5086) tumors were tested at Caris Life Sciences (Phoenix, AZ) with NextGen Sequencing on DNA (592 genes or whole exome) and RNA (whole transcriptome). PD-L1+ (22C3, TPS > 1%) and FOLR1 (Positive [F+], ⩾ 2+, ⩾75%) expression was assessed by IHC. Mutations were defined as pathogenic SNVs/indels (-Mt). Transcriptomic signatures associated with response to immunotherapy (T cell-inflamed) or with MAPK pathway activation (MPAS) were applied. Fisher’s exact/χ 2 and Mann-Whitney U tests were applied as appropriate ( p < .05, adjusted for multiple comparisons). Real-world overall survival (OS) was obtained from insurance claims and Kaplan-Meier estimates were calculated for molecularly defined patients. This study was reviewed by the Johns Hopkins Medicine IRB and determined to qualify as exempt human subjects research. Results: HG tumors had a higher prevalence of F+ tumors (43.5%) as compared to LG (24.6%). HG tumors had a higher prevalence of TP53-Mt compared to LG (LG F+: 11.1%, LG F-: 4.1, HG F+: 97.1, HG F-: 95.6, p < .001). Conversely, KRAS-Mt and NRAS-Mt were enriched in LG tumors (KRAS [LG F+: 22.2%, LG F-: 21.6, HG F+: 0.4, HG F-: 3.3, p < .001], NRAS [LG F+: 0%, LG F-: 10.2, HG F+: 0.2, HG F-: 0.1, p < .001]). BRAF-Mt were also almost exclusively present in LG tumors although more prevalent in LG F- as compared to LG F+ (LG F+: 7.4%, LG F-: 14.3, HG F+: 0.2, HG F-: 0.3, p < .001). There was a higher prevalence of PDL1+ tumors in HG vs LG (LG F+: 39.3%, LG F-: 35.9, HG F+: 70.0, HG F-: 72.4, p < .001). LG tumors had a significantly higher MPAS than HG tumors (LG F+: 1.38 arbitrary units, LG F-: 1.66, HG F+: -0.35, HG F-: -0.25, p < .001). LG F- and HG F- tumors had a similar proportion of T cell-inflamed tumors (LG F-: 36 vs HG F-: 33, p > .05), whereas LG F+ tumors have a significantly lower proportion of T cell-inflamed tumors as compared to HG F+ (LG F+: 18% vs HG F+: 42, p < .001). Amongst tumors that had not received mirvetuximab soravtansine, no difference in OS was observed between HG F- v HG F+ (HR 1.3, p = .072; median OS HG F-: 87 months [N = 1092], HG F+: 98 [N = 756]). No difference in OS was observed when comparing LG F- vs LG F+ (HR 1.0 , p = .93; median OS LG F-: 98 months [N = 116], LG F+: not reached [N = 37]). Conclusions: A notable portion of LG tumors were FOLR1+, which suggests that FOLR1 expression in LG could be a viable target for this rare histology, particularly in the recurrent setting. MAPK activation was significantly higher in LG tumors when compared to HG, yet no difference between LG F+ and F- tumors was observed.