Abstract DNA methylation is a key epigenetic modification in the regulation of cell fate and differentiation, and its analysis is gaining increasing importance in both basic and clinical research. Targeted Bisulfite Sequencing (TBS) has become the method of choice for the cost-effective, targeted analysis of the human methylome at base-pair resolution. Here we benchmarked five commercially available TBS platforms, including three hybridization capture-based (Agilent, Roche, and Illumina) and two RRBS-based (Diagenode and NuGen), across 16 samples. A subset of these were also compared to whole-genome DNA methylation sequencing with the Illumina and Oxford Nanopore platforms. We assessed performance with respect to workflow complexity, on/off-target performance, coverage, accuracy and reproducibility. We find all platforms able to produce usable data but major differences for some performance criteria, especially in the number and identity of the CpG sites covered, which affects the interoperability of datasets generated on these different platforms. To overcome this limitation, we used imputation and show that it improves the interoperability from an average of 10.35% (0.8M CpG sites) to 97% (7.6M CpG sites). Our study provides cross-validated guidance on which TBS platform to use for different features of the methylome and offers an imputation-based harmonization solution for improved interoperability between platforms, allowing comparative and integrative analysis.

Abstract Alpha-tubulin 4A encoding gene (TUBA4A) has been associated with familial amyotrophic lateral sclerosis (fALS) and fronto-temporal dementia (FTD), based on identification of likely pathogenic variants in patients from distinct ALS and FTD cohorts. By screening a multicentric French cohort of 448 unrelated probands presenting with cerebellar ataxia, we identified ultra-rare TUBA4A missense variants, all being absent from public databases and predicted pathogenic by multiple in-silico tools. In addition, gene burden analyses in the 100,000 genomes project (100KGP) showed enrichment of TUBA4A rare variants in the inherited ataxia group compared to controls (OR: 57.0847 [10.2- 576.7]; p = 4.02 x10-07). Altogether, we report 12 patients presenting with spasticity and/or cerebellar ataxia and harboring a predicted pathogenic TUBA4A missense mutation, including 5 confirmed de novo cases and a mutation previously reported in a large family presenting with spastic ataxia. Cultured fibroblasts from 3 patients harboring distinct TUBA4A missense showed significant alterations in microtubule organisation and dynamics, providing insight of TUBA4A variants pathogenicity. Our data confirm the identification of a hereditary spastic ataxia disease gene with variable age of onset, expanding the clinical spectrum of TUBA4A associated phenotypes.