Release of several drugs from new ABA-type biodegradable thermal gels, ReGel, including proteins and conventional molecules, are presented. These are biodegradable, biocompatible polymers that demonstrate reverse thermal gelation properties. Organic solvents are not used in the synthesis, purification, or formulation of these polymers. The unique characteristics of ReGel hinge on the following two key properties: (1) ReGel is a water soluble, biodegradable polymer at temperatures below the gel transition temperature; (2) ReGel forms a water-insoluble gel once injected. This is consistent with a hydrophobically bonded gel state where all interactions are physical, with no covalent crosslinking. An increase in viscosity of approximately 4 orders of magnitude accompanies the sol--gel transition. The gel forms a controlled release drug depot with delivery times ranging from 1 to 6 weeks. ReGel's inherent ability to solubilize (400 to >2000-fold) and stabilize poorly soluble and sensitive drugs, including proteins is a substantial benefit. The gel provided excellent control of the release of paclitaxel for approximately 50 days. Direct intratumoral injection of ReGel/paclitaxel (OncoGel) results in a slow clearance of paclitaxel from the injection site with minimal distribution into any organ. Efficacies equivalent to maximum tolerated systemic dosing were observed at OncoGel doses that were 10-fold lower. Data on protein release (pGH, G-CSF, insulin, rHbsAg) and polymer biocompatibility are discussed.

IgA nephropathy (IgAN) is characterized by circulating immune complexes composed of galactose-deficient IgA1 and a glycan-specific IgG antibody. These immune complexes deposit in the glomerular mesangium and induce the mesangioproliferative glomerulonephritis characteristic of IgAN. To define the precise specificities and molecular properties of the IgG antibodies, we generated EBV-immortalized IgG-secreting lymphocytes from patients with IgAN and found that the secreted IgG formed complexes with galactose-deficient IgA1 in a glycan-dependent manner. We cloned and sequenced the heavy- and light-chain antigen-binding domains of IgG specific for galactose-deficient IgA1 and identified an A to S substitution in the complementarity-determining region 3 of the variable region of the gene encoding the IgG heavy chain in IgAN patients. Furthermore, site-directed mutagenesis that reverted the residue to alanine reduced the binding of recombinant IgG to galactose-deficient IgA1. Finally, we developed a dot-blot assay for the glycan-specific IgG antibody that differentiated patients with IgAN from healthy and disease controls with 88% specificity and 95% sensitivity and found that elevated levels of this antibody in the sera of patients with IgAN correlated with proteinuria. Collectively, these findings indicate that glycan-specific antibodies are associated with the development of IgAN and may represent a disease-specific marker and potential therapeutic target.

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is the most prevalent form of glomerulonephritis worldwide. A renal biopsy is required for an accurate diagnosis, as no convenient biomarker is currently available. We developed a serological test based upon the observation that this nephropathy is characterized by undergalactosylated IgA1 in the circulation and in mesangial immune deposits. In the absence of galactose, the terminal saccharide of O-linked chains in the hinge region of IgA1 is terminal or sialylated N-acetylgalactosamine. A lectin from Helix aspersa, recognizing N-acetylgalactosamine, was used to develop an enzyme-linked immunosorbent assay that measures galactose-deficient IgA1 in serum. The median serum lectin-binding IgA1 level was significantly higher for 153 Caucasian adult patients with IgA nephropathy without progression to end-stage renal disease as compared with that for 150 healthy Caucasian adult controls. As the lectin-binding IgA1 levels for the controls were not normally distributed, the 90th percentile was used for determination of significant elevation. Using a value of 1076 U/ml as the upper limit of normal, 117 of the 153 patients with IgA nephropathy had an elevated serum lectin-binding IgA1 level. The sensitivity as a diagnostic test was 76.5%, with specificity 94%; the positive predictive value was 88.6% and the negative predictive value was 78.9%. We conclude that this lectin-binding assay may have potential as a noninvasive diagnostic test for IgA nephropathy. Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is the most prevalent form of glomerulonephritis worldwide. A renal biopsy is required for an accurate diagnosis, as no convenient biomarker is currently available. We developed a serological test based upon the observation that this nephropathy is characterized by undergalactosylated IgA1 in the circulation and in mesangial immune deposits. In the absence of galactose, the terminal saccharide of O-linked chains in the hinge region of IgA1 is terminal or sialylated N-acetylgalactosamine. A lectin from Helix aspersa, recognizing N-acetylgalactosamine, was used to develop an enzyme-linked immunosorbent assay that measures galactose-deficient IgA1 in serum. The median serum lectin-binding IgA1 level was significantly higher for 153 Caucasian adult patients with IgA nephropathy without progression to end-stage renal disease as compared with that for 150 healthy Caucasian adult controls. As the lectin-binding IgA1 levels for the controls were not normally distributed, the 90th percentile was used for determination of significant elevation. Using a value of 1076 U/ml as the upper limit of normal, 117 of the 153 patients with IgA nephropathy had an elevated serum lectin-binding IgA1 level. The sensitivity as a diagnostic test was 76.5%, with specificity 94%; the positive predictive value was 88.6% and the negative predictive value was 78.9%. We conclude that this lectin-binding assay may have potential as a noninvasive diagnostic test for IgA nephropathy. Since its initial description in 1968,1.Berger J. Hinglais N. Les depots intercapillaires d′IgA-IgG (Intercapillary deposits of IgA-IgG).J Urol Nephrol. 1968; 74: 694-695PubMed Google Scholar immunoglobulin A (IgA) nephropathy (IgAN) has become recognized as the most common primary glomerulonephritis worldwide.2.Julian B.A. Waldo F.B. Rifai A. et al.IgA nephropathy, the most common glomerulonephritis worldwide. A neglected disease in the United States?.Am J Med. 1988; 84: 129-132Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (233) Google Scholar IgAN is characterized by mesangial deposits of IgA1 with co-deposits of C3, and often also IgG or IgM or both.1.Berger J. Hinglais N. Les depots intercapillaires d′IgA-IgG (Intercapillary deposits of IgA-IgG).J Urol Nephrol. 1968; 74: 694-695PubMed Google Scholar, 3.Emancipator S.N. IgA nephropathy and Henoch–Schönlein syndrome.in: Jennette J.C. Olson J.L. Schwartz M.M. Silva F.G. Heptinstall's Pathology of the Kidney. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia1998: 479-539Google Scholar, 4.Conley M.E. Cooper M.D. Michael A.F. Selective deposition of immunoglobulin A1 in immunoglobulin A nephropathy, anaphylactoid purpura nephritis, and systemic lupus erythematosus.J Clin Invest. 1980; 66: 1432-1436Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar, 5.Julian B.A. Novak J. IgA nephropathy: an update.Current Opin Nephrol Hypertens. 2004; 13: 171-179Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar, 6.Novak J. Julian B.A. Tomana M. et al.Progress in molecular and genetic studies of IgA nephropathy.J Clin Immunol. 2001; 21: 310-327Crossref PubMed Scopus (99) Google Scholar Over 50% of IgAN patients exhibit increased serum levels of IgA and IgA-containing circulating immune complexes (CIC).7.Czerkinsky C. Koopman W.J. Jackson S. et al.Circulating immune complexes and immunoglobulin A rheumatoid factor in patients with mesangial immunoglobulin A nephropathies.J Clin Invest. 1986; 77: 1931-1938Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar, 8.Coppo R. Basolo B. Piccoli G. et al.IgA1 and IgA2 immune complexes in primary IgA nephropathy and Henoch–Schönlein nephritis.Clin Exp Immunol. 1984; 57: 583-590PubMed Google Scholar, 9.Schena F.P. Pastore A. Ludovico N. et al.Increased serum levels of IgA1-IgG immune complexes and anti-F(ab′)2 antibodies in patients with primary IgA nephropathy.Clin Exp Immunol. 1989; 77: 15-20PubMed Google Scholar The mesangial immune deposits likely originate from these CIC. We have found that these complexes contain aberrantly glycosylated polymeric IgA1 (galactose (Gal)-deficient in O-linked glycans).10.Tomana M. Novak J. Julian B.A. et al.Circulating immune complexes in IgA nephropathy consist of IgA1 with galactose-deficient hinge region and antiglycan antibodies.J Clin Invest. 1999; 104: 73-81Crossref PubMed Scopus (392) Google Scholar, 11.Tomana M. Matousovic K. Julian B.A. et al.Galactose-deficient IgA1 in sera of IgA nephropathy patients is present in complexes with IgG.Kidney Int. 1997; 52: 509-516Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (279) Google Scholar, 12.Novak J. Vu H.L. Novak L. et al.Interactions of human mesangial cells with IgA and IgA-containing circulating immune complexes.Kidney Int. 2002; 62: 465-475Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (123) Google Scholar, 13.Novak J. Tomana M. Matousovic K. et al.IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy differentially affect proliferation of mesangial cells.Kidney Int. 2005; 67: 504-513Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (173) Google ScholarIn vitro studies have demonstrated that these CIC readily bind to mesangial cells and induce their proliferation.12.Novak J. Vu H.L. Novak L. et al.Interactions of human mesangial cells with IgA and IgA-containing circulating immune complexes.Kidney Int. 2002; 62: 465-475Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (123) Google Scholar, 13.Novak J. Tomana M. Matousovic K. et al.IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy differentially affect proliferation of mesangial cells.Kidney Int. 2005; 67: 504-513Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (173) Google Scholar, 14.Moura I.C. Arcos-Fajardo M. Sadaka C. et al.Glycosylation and size of IgA1 are essential for interaction with mesangial transferrin receptor in IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2004; 15: 622-634Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar, 15.Coppo R. Amore A. Aberrant glycosylation in IgA nephropathy (IgAN).Kidney Int. 2004; 65: 1544-1547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (152) Google Scholar, 16.Amore A. Cirina P. Conti G. et al.Glycosylation of circulating IgA in patients with IgA nephropathy modulates proliferation and apoptosis of mesangial cells.J Am Soc Nephrol. 2001; 12: 1862-1871PubMed Google Scholar Thus, aberrantly glycosylated polymeric IgA1 may be involved in the pathogenesis of the glomerular injury in IgAN. Indeed, elution of glomerular immune deposits from renal tissue of patients with IgAN has demonstrated substantial quantities of Gal-deficient IgA1.17.Allen A.C. Bailey E.M. Brenchley P.E.C. et al.Mesangial IgA1 in IgA nephropathy exhibits aberrant O-glycosylation: observations in three patients.Kidney Int. 2001; 60: 969-973Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (268) Google Scholar,18.Hiki Y. Odani H. Takahashi M. et al.Mass spectrometry proves under-O-glycosylation of glomerular IgA1 in IgA nephropathy.Kidney Int. 2001; 59: 1077-1085Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (299) Google Scholar Several laboratories have localized the aberrant glycosylation to the O-linked glycans in the hinge region of some IgA1 molecules.5.Julian B.A. Novak J. IgA nephropathy: an update.Current Opin Nephrol Hypertens. 2004; 13: 171-179Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar, 15.Coppo R. Amore A. Aberrant glycosylation in IgA nephropathy (IgAN).Kidney Int. 2004; 65: 1544-1547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (152) Google Scholar, 19.Floege J. Feehally J. IgA nephropathy: recent developments.J Am Soc Nephrol. 2000; 11: 2395-2403PubMed Google Scholar, 20.Smith A.C. Feehally J. New insights into the pathogenesis of IgA nephropathy. Pathogenesis of IgA nephropathy.Springer Semin Immunopathol. 2003; 24: 477-493Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar, 21.Barratt J. Feehally J. IgA Nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2005; 16: 2088-2097Crossref PubMed Scopus (397) Google Scholar In the absence of Gal, the terminal N-acetylgalactosamine (GalNAc) residues, sialylated GalNAc, or the hinge-region glycopeptides are recognized by naturally occurring IgG or IgA1 antibodies with anti-glycan or anti-hinge region peptide specificities, thus generating CIC.10.Tomana M. Novak J. Julian B.A. et al.Circulating immune complexes in IgA nephropathy consist of IgA1 with galactose-deficient hinge region and antiglycan antibodies.J Clin Invest. 1999; 104: 73-81Crossref PubMed Scopus (392) Google Scholar Some of the resultant CIC escape normal clearance and deposit in the mesangium. These observations support the postulate that O-glycosylation abnormalities of IgA1 predispose to mesangial IgA deposition.5.Julian B.A. Novak J. IgA nephropathy: an update.Current Opin Nephrol Hypertens. 2004; 13: 171-179Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar, 12.Novak J. Vu H.L. Novak L. et al.Interactions of human mesangial cells with IgA and IgA-containing circulating immune complexes.Kidney Int. 2002; 62: 465-475Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (123) Google Scholar, 14.Moura I.C. Arcos-Fajardo M. Sadaka C. et al.Glycosylation and size of IgA1 are essential for interaction with mesangial transferrin receptor in IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2004; 15: 622-634Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar, 15.Coppo R. Amore A. Aberrant glycosylation in IgA nephropathy (IgAN).Kidney Int. 2004; 65: 1544-1547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (152) Google Scholar, 21.Barratt J. Feehally J. IgA Nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2005; 16: 2088-2097Crossref PubMed Scopus (397) Google Scholar, 22.van der Boog P.J. van Kooten C. van Seggelen A. et al.An increased polymeric IgA level is not a prognostic marker for progressive IgA nephropathy.Nephrol Dial Transplant. 2004; 19: 2487-2493Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar For the diagnosis of IgAN, a renal biopsy is required because there is no established serological marker. To avoid this invasive procedure, particularly in individuals with mild disease, we sought to develop a noninvasive test to support the diagnosis of IgAN using a GalNAc-specific lectin. Based on previous work by our group and others, the lectin from Helix aspersa (HAA) is well suited for detecting Gal-deficient IgA1 O-linked glycans.10.Tomana M. Novak J. Julian B.A. et al.Circulating immune complexes in IgA nephropathy consist of IgA1 with galactose-deficient hinge region and antiglycan antibodies.J Clin Invest. 1999; 104: 73-81Crossref PubMed Scopus (392) Google Scholar, 11.Tomana M. Matousovic K. Julian B.A. et al.Galactose-deficient IgA1 in sera of IgA nephropathy patients is present in complexes with IgG.Kidney Int. 1997; 52: 509-516Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (279) Google Scholar, 15.Coppo R. Amore A. Aberrant glycosylation in IgA nephropathy (IgAN).Kidney Int. 2004; 65: 1544-1547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (152) Google Scholar, 16.Amore A. Cirina P. Conti G. et al.Glycosylation of circulating IgA in patients with IgA nephropathy modulates proliferation and apoptosis of mesangial cells.J Am Soc Nephrol. 2001; 12: 1862-1871PubMed Google Scholar, 17.Allen A.C. Bailey E.M. Brenchley P.E.C. et al.Mesangial IgA1 in IgA nephropathy exhibits aberrant O-glycosylation: observations in three patients.Kidney Int. 2001; 60: 969-973Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (268) Google Scholar, 23.Allen A.C. Harper S.J. Feehally J. Galactosylation of N- and O-linked carbohydrate moieties of IgA1 and IgG in IgA nephropathy.Clin Exp Immunol. 1995; 100: 470-474Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar, 24.Carpenter G.H. Proctor G.B. Shori D.K. O-glycosylation of salivary IgA as determined by lectin analysis.Biochem Soc Trans. 1997; 25: S659Crossref PubMed Scopus (4) Google Scholar, 25.Hiki Y. Kokubo T. Iwase H. et al.Underglycosylation of IgA1 hinge plays a certain role for its glomerular deposition in IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 1999; 10: 760-769PubMed Google Scholar, 26.Moore J.S. Kulhavy R. Tomana M. et al.Reactivities of N-acetylgalactosamine-specific lectins with human IgA1 proteins.Mol Immunol. 2007; 44: 2598-2604Crossref PubMed Scopus (75) Google Scholar In this study, we show that a quantitative lectin-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) can be successfully used to measure serum levels of Gal-deficient IgA in sera of patients with IgAN. Median serum IgA concentration was 3 943 μg/ml (range 1 171–11 713 μg/ml) for 153 Caucasian IgAN patients who had not progressed to end-stage renal disease as compared with 2 843 μg/ml (range 886–8 185 μg/ml) for 150 healthy controls (P<0.0001) (Table 1). Fifty patients had a serum IgA concentration higher than 4 761 μg/ml (90th percentile for controls). These data indicate a sensitivity of 32.7% and specificity of 90% with a positive predictive value of 76.9% and a negative predictive value of 56.7% (Table 2). In agreement with a previous publication,22.van der Boog P.J. van Kooten C. van Seggelen A. et al.An increased polymeric IgA level is not a prognostic marker for progressive IgA nephropathy.Nephrol Dial Transplant. 2004; 19: 2487-2493Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar the diagnostic utility of total levels of serum IgA was not satisfactory.Table 1Clinical features and levels of serum IgA and HAA-IgA for subgroups of patients with IgA nephropathyGroupNGender ratio (M/F)Age at diagnosis (years) mean±SDInterval to study (years) mean±SDHAA-IgA (U/ml) median (range)IgA (μg/ml) median (range)HAA-IgA (U/mg IgA) median (range)UP/Cr ratio median (range)GFRaEstimated GFR was calculated using the MDRD formula (53). (ml/min/1.73 m2) mean±SDAll patients1531.6837.0±14.54.9±6.91 731 (320–8 317)3 943 (1 171–11 713)445 (129–879)0.60 (0.06–19.3)57.0±31.4Male patients9639.8±15.03.9±5.61 731 (373–8 317)3 846 (1 171–11 713)455 (129–834)0.65 (0.06–5.35)53.3±30.8Female patients5732.2±27.86.5±8.41 707 (320–4 366)4 213 (1 409–7 283)428 (129–879)0.54 (0.06–19.3)63.1±32.0<8 weeks after biopsy341.6237.5±14.10.06±0.041 800 (508–4 366)3 956 (1 418–6 327)451 (160–879)0.81 (0.07–4.36)61.0±39.0>5 years after biopsy461.0930.2±11.913.3±7.01 974 (504–4 391)4 440 (2 037–9 148)425 (129–812)0.19 (0.06–19.3)60.7±38.5GFR<30 ml/min/1.73 m2353.3842.0±15.54.5±7.21 856 (391–4 391)3 584 (1 418–8 887)525 (141–879)1.25 (0.07–7.46)17.9±6.8GFR>90 ml/min/1.73 m2261.1727.5±9.53.2±4.91 466 (320–3 579)3 299 (1 409–7 422)373 (170–710)0.38 (0.06–2.53)105.0±16.3Normal urinalysis261.3630.0±10.311.8±8.92 030 (504–3 901)4 571 (2 037–7 350)417 (208–820)0.09 (0.06–0.19)45.5±16.2GFR, glomerular filtration rate; HAA, lectin from Helix aspersa; IgA, immunoglobulin A; UP/Cr ratio, urinary protein/creatinine ratio.a Estimated GFR was calculated using the MDRD formula (53). Open table in a new tab Table 2Diagnostic utility of serum IgA and HAA-IgA assaysControlPatientsSensitivitySpecificityPositive predictiveNegative predictiveYesNoYesNoIgA >4 761 μg/ml15135501030.327 (0.258, 0.405)0.900 (0.842, 0.938)0.769 (0.654, 0.855)0.567 (0.504, 0.629)HAA-IgA >1 076 U/ml15135116370.758 (0.685, 0.819)0.900 (0.842, 0.938)0.885 (0.820, 0.929)0.785 (0.718, 0.840)HAA-IgA >394 U/mg IgA1513594590.614 (0.535, 0.685)0.900 (0.842, 0.938)0.785 (0.628, 0.756)0.696 (0.628, 0.756)HAA, lectin from Helix aspersa; IgA, immunoglobulin A.The numbers in the brackets are the 95% confidence intervals. Open table in a new tab GFR, glomerular filtration rate; HAA, lectin from Helix aspersa; IgA, immunoglobulin A; UP/Cr ratio, urinary protein/creatinine ratio. HAA, lectin from Helix aspersa; IgA, immunoglobulin A. The numbers in the brackets are the 95% confidence intervals. Serum HAA-IgA levels for the patient and healthy control groups are shown in Figure 1a. The individual levels for the control group were not distributed normally with a marked skewing towards elevated levels. The median serum HAA-IgA level for the patients of 1 731 U/ml (range 320–8 317 U/ml) was significantly higher than the median of 615 U/ml (range 264–1 807 U/ml) for the control group (P<0.0001). The serum HAA-IgA level was higher than 1 076 U/ml (90th percentile for controls) for 117 of the 153 patients. These data indicate a sensitivity of 76.5% and a specificity of 90% with a positive predictive value of 88.6% and a negative predictive value of 78.9%. To illustrate the potential of this assay, the results are also presented as a receiver operating characteristic curve in Figure 1b. The area under the curve is 0.9021 with a standard error 0.0178, indicating that the true-positive rate was high and the false-positive rate was low. The 95% confidence interval was 0.8672–0.9370 (P<0.0001). Reproducibility of the HAA-IgA ELISA was high (repeated the assays had an r=0.970; P<0.0001). The serum HAA-IgA and IgA levels correlated significantly in IgAN patients (r2=0.571, P<0.0001) and healthy controls (r2=0.392, P<0.0001). The median value of the HAA-binding fraction of IgA was 445 U/mg IgA (range 129–879) for 153 Caucasian IgAN patients who had not progressed to end-stage renal disease as compared with 248 U/mg IgA (range 56–666) for 150 healthy controls (P<0.0001). Ninety-four patients had a HAA-binding fraction of IgA higher than 394 U/mg IgA (90th percentile for controls). These data indicate a sensitivity of 61.4% and specificity of 90% with a positive predictive value of 86.2% and a negative predictive value of 69.6%. Seven of 36 patients with normal HAA-IgA levels had an HAA-binding fraction of IgA above the 90th percentile for controls; among the 135 healthy controls with a HAA-IgA level below the cutoff point, 11 had a similarly increased value for HAA-binding fraction of IgA. To verify the ELISA data, selected serum samples from four IgAN patients and two healthy controls representing a wide range of HAA-IgA values were analyzed by Western blotting for total and Gal-deficient IgA (see Materials and methods). The band intensity was measured by densitometry and the ratio of HAA-IgA to IgA heavy chain was calculated. This value was plotted against HAA-binding fraction of IgA1 (U/mg IgA) determined by ELISA in the same sample. The data in Figure 2 are representative for the IgAN patients and healthy controls over the wide range of HAA-IgA values. The results from the two assays showed good correlation (r2=0.818, P=0.046). Serum HAA-IgA and IgA concentrations as well as values for the HAA-binding fraction of IgA (U/mg IgA) are shown for subgroups of patients in Table 2. There was no significant difference based upon gender. The median level for 26 patients with a normal urinalysis at the time of study was 2 030 Units/ml (88% with an elevated level). Levels of HAA-IgA for subjects with an estimated glomerular filtration rate (GFR) ≥90 ml/min/1.73 m2 were similar to those of patients with an estimated GFR <30 ml/min/1.73 m2. Furthermore, the HAA-IgA levels did not significantly differ between patients who had undergone renal biopsy within eight weeks of the blood sampling and patients whose blood was obtained more than five years after biopsy. Serum HAA-IgA levels did not significantly correlate with urinary protein/creatinine (UP/Cr) ratio (r=-0.128, P=0.211), estimated GFR (r=-0.147, P=0.069), or interval since biopsy (r=0.0844, P=0.300). Thus, the serum HAA-IgA level did not appear to be an indicator of disease activity in our cohort of Caucasian adults with IgAN. Renal biopsies from 34 patients, who had blood obtained within eight weeks of diagnostic biopsy, were graded according to the Haas system27.Haas M. Histologic subclassification of IgA nephropathy: a clinicopathologic study of 244 cases.Am J Kidney Dis. 1997; 29: 829-842Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (397) Google Scholar by two investigators (WJC and BAJ) blinded to the clinical and laboratory data. Levels of HAA-IgA were above the cutoff value of healthy controls in five of eight (63%) patients with subclass 1, 2, and 3 histological features and in 20 of 26 (77%) patients with subclass 4 and 5 disease. In this study, we developed a quantitative assay to measure serum Gal-deficient IgA (HAA-IgA). Although the total IgA correlated with the HAA-IgA levels, only the serum HAA-IgA level differentiated IgAN patients from the healthy controls with high sensitivity (Table 2). This finding may be explained by a greater amount of Gal-deficient IgA recognized by naturally occurring anti-glycan antibodies, resulting in formation of CIC.10.Tomana M. Novak J. Julian B.A. et al.Circulating immune complexes in IgA nephropathy consist of IgA1 with galactose-deficient hinge region and antiglycan antibodies.J Clin Invest. 1999; 104: 73-81Crossref PubMed Scopus (392) Google Scholar In our ELISA, serum IgA was captured by a polyclonal IgA heavy chain-specific antibody. As a result, both subclasses, IgA1 that accounts for about 84% of serum IgA28.Mestecky J. Russell M.W. IgA subclasses.Monogr Allergy. 1986; 19: 277-301PubMed Google Scholar,29.Mestecky J. Russell M.W. Jackson S. et al.The human IgA system: a reassessment.Clin Immunol Immunopathol. 1986; 40: 105-114Crossref PubMed Scopus (176) Google Scholar and IgA2, are captured. However, only IgA1 has O-linked glycans and, therefore, is the only IgA subclass that can bind to HAA, a GalNAc-specific lectin. Consequently, the HAA-IgA assay is a measure of serum Gal-deficient IgA1. Mesangial IgA deposition is incidentally encountered in asymptomatic individuals in frequencies that vary among studies, ranging from 2 to 16%.30.Waldherr R. Rambousek M. Duncker W.D. et al.Frequency of mesangial IgA deposits in non-selected autopsy series.Nephrol Dial Transplant. 1989; 4: 943-946PubMed Google Scholar, 31.Sinniah R. Occurence of mesangial IgA and IgM deposits in a control necropsy population.J Clin Pathol. 1983; 36: 276-279Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar, 32.Varis J. Rantala I. Pasternack A. et al.Immunoglobulin and complement deposition in glomeruli of 756 subjects who had committed suicide or met with a violent death.J Clin Pathol. 1993; 46: 607-610Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar, 33.Suzuki K. Honda K. Tanabe K. et al.Incidence of latent mesangial IgA deposition in renal allograft donors in Japan.Kidney Int. 2003; 63: 2286-2294Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (209) Google Scholar, 34.Rosenberg H.G. Martinez P.S. Vaccarezza A.S. et al.Morphological findings in 70 kidneys of living donors for renal transplant.Pathol Res Pract. 1990; 186: 619-624Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar For example, in a study in Japan, biopsies from 510 newly procured living-donor renal allografts taken at the time of transplantation showed mesangial IgA deposition in 82 (16.1%) of them.33.Suzuki K. Honda K. Tanabe K. et al.Incidence of latent mesangial IgA deposition in renal allograft donors in Japan.Kidney Int. 2003; 63: 2286-2294Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (209) Google Scholar By contrast, in a study of necropsy examinations of 756 Finish adults who had committed suicide or met with a violent death, mesangial IgA deposits were found in 18 (2.4%) of the individuals.32.Varis J. Rantala I. Pasternack A. et al.Immunoglobulin and complement deposition in glomeruli of 756 subjects who had committed suicide or met with a violent death.J Clin Pathol. 1993; 46: 607-610Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar However, these renal biopsies with IgA deposits rarely showed any significant pathological changes by light microscopy. Consequently, the clinical significance of these observations is not clear, but many otherwise normal healthy individuals may have mesangial deposits of IgA without clinical manifestation of nephritis or pathological changes of the glomeruli. It would have been interesting to have renal biopsy data on our cohort of healthy controls and to assess the frequency of IgA deposits with and without concurrent renal pathology by light microscopy. However, this could not have been carried out for ethical reasons. Several groups of investigators have shown significantly increased binding of GalNAc-specific lectins to serum IgA1 from patients with IgAN or Henoch–Schönlein purpura nephritis.10.Tomana M. Novak J. Julian B.A. et al.Circulating immune complexes in IgA nephropathy consist of IgA1 with galactose-deficient hinge region and antiglycan antibodies.J Clin Invest. 1999; 104: 73-81Crossref PubMed Scopus (392) Google Scholar, 11.Tomana M. Matousovic K. Julian B.A. et al.Galactose-deficient IgA1 in sera of IgA nephropathy patients is present in complexes with IgG.Kidney Int. 1997; 52: 509-516Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (279) Google Scholar, 23.Allen A.C. Harper S.J. Feehally J. Galactosylation of N- and O-linked carbohydrate moieties of IgA1 and IgG in IgA nephropathy.Clin Exp Immunol. 1995; 100: 470-474Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar, 35.Andre P.M. Le Pogamp P. Chevet D. Impairment of jacalin binding to serum IgA in IgA nephropathy.J Clin Lab Anal. 1990; 4: 115-119Crossref PubMed Scopus (98) Google Scholar, 36.Hiki Y. Horii A. Iwase H. et al.O-linked oligosaccharide on IgA1 hinge region in IgA nephropathy. Fundamental study for precise structure and possible role.Contrib Nephrol. 1995; 111: 73-84Crossref PubMed Google Scholar, 37.Mestecky J. Tomana M. Crowley-Nowick P.A. et al.Defective galactosylation and clearance of IgA1 molecules as a possible etiopathogenic factor in IgA nephropathy.Contrib Nephrol. 1993; 104: 172-182Crossref PubMed Google Scholar, 38.Allen A.C. Willis F.R. Beattie T.J. et al.Abnormal IgA glycosylation in Henoch–Schönlein purpura restricted to patients with clinical nephritis.Nephrol Dial Transplant. 1998; 13: 930-934Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar, 39.Linossier M.T. Palle S. Berthoux F. Different glycosylation profile of serum IgA1 in IgA nephropathy according to the glomerular basement membrane thickness: normal versus thin.Am J Kidney Dis. 2003; 41: 558-564Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (29) Google Scholar, 40.Hashim O.H. Shuib A.S. Chua C.T. The interaction of selective plant lectins with neuraminidase-treated and untreated IgA1 from the sera of IgA nephropathy patients.Immunol Invest. 2001; 30: 21-31Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar Using HAA, Linossier et al.39.Linossier M.T. Palle S. Berthoux F. Different glycosylation profile of serum IgA1 in IgA nephropathy according to the glomerular basement membrane thickness: normal versus thin.Am J Kidney Dis. 2003; 41: 558-564Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (29) Google Scholar showed increased binding for IgAN patients with normal thickness of the glomerular basement membrane on electron microscopy. Studies with other GalNAc-specific lectins, Vicia villosa lectin23.Allen A.C. Harper S.J. Feehally J. Galactosylation of N- and O-linked carbohydrate moieties of IgA1 and IgG in IgA nephropathy.Clin Exp Immunol. 1995; 100: 470-474Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar,38.Allen A.C. Willis F.R. Beattie T.J. et al.Abnormal IgA glycosylation in Henoch–Schönlein purpura restricted to patients with clinical nephritis.Nephrol Dial Transplant. 1998; 13: 930-934Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar and Glycine max lectin,40.Hashim O.H. Shuib A.S. Chua C.T. The interaction of selective plant lectins with neuraminidase-treated and untreated IgA1 from the sera of IgA nephropathy patients.Immunol Invest. 2001; 30: 21-31Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar showed increased serum Gal-deficient IgA1 in patients with Henoch–Schönlein purpura nephritis and IgAN, respectively. However, these results did not distinguish the patients from healthy controls; thus, the test would not be adequate to diagnose either disorder. Several candidates for a serological diagnostic marker of IgAN, such as increased levels of serum IgA or of IgA-containing complexes with fibronectin, IgG, or C3, have been previously examined.7.Czerkinsky C. Koopman W.J. Jackson S. et al.Circulating immune complexes and immunoglobulin A rheumatoid factor in patients with mesangial immunoglobulin A nephropathies.J Clin Invest. 1986; 77: 1931-1938Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar, 8.Coppo R. Basolo B. Piccoli G. et al.IgA1 and IgA2 immune complexes in primary IgA nephropathy and Henoch–Schönlein nephritis.Clin Exp Immunol. 1984; 57: 583-590PubMed Google Scholar, 9.Schena F.P. Pastore A. Ludovico N. et al.Increased serum levels of IgA1-IgG immune complexes and anti-F(ab′)2 antibodies in patients with primary IgA nephropathy

Although high serum levels of galactose-deficient IgA1 (an important biomarker of IgA nephropathy (IgAN)) are found in most patients with IgAN, their relationship to disease severity and progression remains unclear. To help clarify this we prospectively enrolled 275 patients with IgAN and followed them for a median of 47 months (range 12–96 months). Serum galactose–deficient IgA1 was measured at the time of diagnosis using a lectin-based ELISA, and renal survival was modeled using the Cox proportional hazards method. The serum levels of galactose-deficient IgA1 were higher in patients with IgAN compared to those in healthy controls. Importantly, in adjusted analysis, higher levels of galactose-deficient IgA1 were independently associated with a greater risk of deterioration in renal function with a hazard ratio of 1.44 per standard deviation of the natural log–transformed galactose-deficient IgA1 concentration. In reference to the first quartile, the risk of kidney failure increased such that the hazard ratio for the second quartile was 2.47, 3.86 for the third, and 4.76 for the fourth quartile of the galactose-deficient IgA1 concentration. Hence, elevated serum levels of galactose-deficient IgA1 are associated with a poor prognosis in IgAN. Although high serum levels of galactose-deficient IgA1 (an important biomarker of IgA nephropathy (IgAN)) are found in most patients with IgAN, their relationship to disease severity and progression remains unclear. To help clarify this we prospectively enrolled 275 patients with IgAN and followed them for a median of 47 months (range 12–96 months). Serum galactose–deficient IgA1 was measured at the time of diagnosis using a lectin-based ELISA, and renal survival was modeled using the Cox proportional hazards method. The serum levels of galactose-deficient IgA1 were higher in patients with IgAN compared to those in healthy controls. Importantly, in adjusted analysis, higher levels of galactose-deficient IgA1 were independently associated with a greater risk of deterioration in renal function with a hazard ratio of 1.44 per standard deviation of the natural log–transformed galactose-deficient IgA1 concentration. In reference to the first quartile, the risk of kidney failure increased such that the hazard ratio for the second quartile was 2.47, 3.86 for the third, and 4.76 for the fourth quartile of the galactose-deficient IgA1 concentration. Hence, elevated serum levels of galactose-deficient IgA1 are associated with a poor prognosis in IgAN. IgA nephropathy (IgAN) is the most common form of primary glomerulonephritis worldwide1.Levy M. Berger J. Worldwide perspective of IgA nephropathy.Am J Kidney Dis. 1988; 12: 340-347Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (214) Google Scholar and the leading cause of end-stage renal disease (ESRD) in young adults.2.Nair R. Walker P.D. Is IgA nephropathy the commonest primary glomerulopathy among young adults in the USA?.Kidney Int. 2006; 69: 1455-1458Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (138) Google Scholar The pattern of glomerular immunoglobulin deposits is suggestive of an immune complex–mediated mechanism.3.Donadio J.V. Grande J.P. IgA nephropathy.N Engl J Med. 2002; 347: 738-748Crossref PubMed Scopus (681) Google Scholar, 4.Smith A.C. Molyneux K. Feehally J. et al.O-glycosylation of serum IgA1 antibodies against mucosal and systemic antigens in IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 3520-3528Crossref PubMed Scopus (100) Google Scholar, 5.Suzuki H. Fan R. Zhang Z. et al.Aberrantly glycosylated IgA1 in IgA nephropathy patients is recognized by IgG antibodies with restricted heterogeneity.J Clin Invest. 2009; 119: 1668-1677PubMed Google Scholar, 6.Tomana M. Matousovic K. Julian B.A. et al.Galactose-deficient IgA1 in sera of IgA nephropathy patients is present in complexes with IgG.Kidney Int. 1997; 52: 509-516Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (280) Google Scholar, 7.Novak J. Julian B.A. Tomana M. et al.IgA glycosylation and IgA immune complexes in the pathogenesis of IgA nephropathy.Semin Nephrol. 2008; 28: 78-87Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (158) Google Scholar Multiple studies have established the contribution of aberrantly glycosylated IgA1 in the pathogenesis of IgAN.8.Amore A. Cirina P. Conti G. et al.Glycosylation of circulating IgA in patients with IgA nephropathy modulates proliferation and apoptosis of mesangial cells.J Am Soc Nephrol. 2001; 12: 1862-1871PubMed Google Scholar, 9.Barratt J. Feehally J. Smith A.C. Pathogenesis of IgA nephropathy.Semin Nephrol. 2004; 24: 197-217Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (118) Google Scholar, 10.Barratt J. Feehally J. IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2005; 16: 2088-2097Crossref PubMed Scopus (401) Google Scholar, 11.Smith A.C. de Wolff J.F. Molyneux K. et al.O-glycosylation of serum IgD in IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 1192-1199Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar, 12.Suzuki H. Moldoveanu Z. Hall S. et al.IgA1-secreting cell lines from patients with IgA nephropathy produce aberrantly glycosylated IgA1.J Clin Invest. 2008; 118: 629-639PubMed Google Scholar IgA1 is one of the very few serum proteins with O-glycosylation. The O-glycans in the hinge region of normal IgA1 consist of N-acetylgalactosamine, galactose, and sialic acid. In patients with IgAN, some of the O-glycans of circulating IgA1 are deficient in galactose. Similarly, mesangial immune deposits eluted directly from glomeruli of IgAN patients contained galactose-deficient IgA1 (Gd-IgA1).7.Novak J. Julian B.A. Tomana M. et al.IgA glycosylation and IgA immune complexes in the pathogenesis of IgA nephropathy.Semin Nephrol. 2008; 28: 78-87Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (158) Google Scholar, 13.Allen A.C. Bailey E.M. Brenchley P.E. et al.Mesangial IgA1 in IgA nephropathy exhibits aberrant O-glycosylation: observations in three patients.Kidney Int. 2001; 60: 969-973Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (268) Google Scholar, 14.Hiki Y. Odani H. Takahashi M. et al.Mass spectrometry proves under-O-glycosylation of glomerular IgA1 in IgA nephropathy.Kidney Int. 2001; 59: 1077-1085Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (299) Google Scholar On the basis of the potential pathogenic role of Gd-IgA1 in the development of IgAN, a quantitative assay for serum Gd-IgA1 holds promise as a non-invasive diagnostic tool. We previously reported an increased binding of a N-acetylgalactosamine-specific lectin from Helix aspersa (HAA) to desialylated serum Gd-IgA1 in Caucasian patients with IgAN.15.Moldoveanu Z. Wyatt R.J. Lee J.Y. et al.Patients with IgA nephropathy have increased serum galactose-deficient IgA1 levels.Kidney Int. 2007; 71: 1148-1154Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (292) Google Scholar Our earlier study demonstrated that Gd-IgA1 was also closely associated with the pathologic phenotype of IgAN.16.Xu L.X. Zhao M.H. Aberrantly glycosylated serum IgA1 are closely associated with pathologic phenotypes of IgA nephropathy.Kidney Int. 2005; 68: 167-172Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (88) Google Scholar However, it is not known whether elevated levels of Gd-IgA1 in sera of IgAN patients are associated with accelerated disease progression, or a worse prognosis.17.Coppo R. Amore A. Aberrant glycosylation in IgA nephropathy (IgAN).Kidney Int. 2004; 65: 1544-1547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (152) Google Scholar We have previously established a large prospective cohort of patients with IgAN followed regularly at the Peking University Institute of Nephrology. This cohort has been assembled and followed as part of the Peking University IgAN database project since 2003 (http://www.renal-online.org), with blood and urine samples collected at the time of kidney biopsy, and clinical data collected prospectively for all enrolled patients. In this study, we utilize the above resource to examine the prognostic utility of serum levels Gd-IgA1. Among the 275 IgAN patients, there were 147 (53.5%) males and 128 (46.5%) females with mean age at the time of kidney biopsy of 32.7±10.7 years. On biopsy, average proteinuria level was 1.92±1.89g per 24h (range 0.01–13.72g/24h) and average estimated glomerular filtration rate (eGFR) was 82.65±27.44ml/min per 1.73m2 (range 6.3–164.9ml/min per 1.73m2). Systolic blood pressure was 124±16mmHg, diastolic blood pressure 79±12mmHg, with 131 patients (47.6%) being hypertensive at baseline. The distribution by Haas grade I, II, III, IV, and V was 10.9%, 0.4%, 32.4%, 42.9%, and 13.5%, respectively. The median follow-up time was 47 months (range 12–96 months; Table 1). During the follow-up period, 266 (96.7%) patients received ACE inhibitors or ARBs therapy, 127 (46.2%) received oral corticosteroids alone or combined with other immunosuppressive agents. In total, 42 patients reached the composite end point of 50% decline in eGFR (n=39), ESRD (n=3), or death (n=2; both had a 50% decline in eGFR before death).Table 1Baseline clinical and laboratory data and levels of serum Gd-IgA1 in 275 patients with IgANCharacteristicsMean±s.d. (range or percentage)Age (year)32.7±10.7 (15–76)Gender (male)147/275 (53.5%)SBP (mmHg)124±16DBP (mmHg)79±12Hypertension (%)aHypertension was defined as SBP of greater than 140mmHg, and/or DBP of greater than 90mmHg at resting, or use of anti-hypertension medication.131/275 (47.6%)Initial proteinuria (g/day)1.92±1.89 <0.3 (%)15/275 (5.5%) 0.3–0.99 (%)84/275 (30.5%) 1.0–2.99 (%)130/275 (47.3%) ≥3.0 (%)46/275 (16.7%)eGFR (ml/min per 1.73m2)82.65±27.44Stages 1, 2, 3, and 4 CKD (KDOQI)bCKD stage 1, 2, 3, and 4 were divided by eGFR≥90, 60–89, 30–59, and 15–29, respectively.125 (45.7%), 92 (33.3%), 50 (18.0%), 8 (3%)Follow-up interval (month, median, IQR)47 (30–60)Gd-IgA1 (U/ml, median, IQR)312.5 (236.5–407.8)Total IgA (μg/ml, median, IQR)2630.0 (2125.0–3510.0)Plasma IgA1 (μg/ml, median, IQR)1709.9 (1376.2–2159.7)Therapy (%) ACE inhibitors or ARBs96.7 Prednisone46.2 Any other immunosuppressive agents (cyclophosphamide, MMF, or others)29.8Histological grading (%)cHistological grading was classified according to pathological scheme proposed by Haas.45 I, II, III, IV, V30 (10.9%), 1 (0.36%), 89 (32.4%), 118 (42.9%), 37 (13.5%)Abbreviations: ACE, angiotensin-converting enzyme; ARB, angiotensin II receptor blocker; CKD, chronic kidney disease; DBP, diastolic blood pressure; eGFR, estimate glomerular filtration rate; Gd-IgA1, galactose-deficient IgA1; IgAN, IgA nephropathy; IQR, interquartile range; MMF, mycophenolate mofetil; SBP, systolic blood pressure.a Hypertension was defined as SBP of greater than 140mmHg, and/or DBP of greater than 90mmHg at resting, or use of anti-hypertension medication.b CKD stage 1, 2, 3, and 4 were divided by eGFR≥90, 60–89, 30–59, and 15–29, respectively.c Histological grading was classified according to pathological scheme proposed by Haas.45.Haas M. Histologic subclassification of IgA nephropathy: a clinicopathologic study of 244 cases.Am J Kidney Dis. 1997; 29: 829-842Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (399) Google Scholar Open table in a new tab Abbreviations: ACE, angiotensin-converting enzyme; ARB, angiotensin II receptor blocker; CKD, chronic kidney disease; DBP, diastolic blood pressure; eGFR, estimate glomerular filtration rate; Gd-IgA1, galactose-deficient IgA1; IgAN, IgA nephropathy; IQR, interquartile range; MMF, mycophenolate mofetil; SBP, systolic blood pressure. HAA-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Gd-IgA1 was highly reproducible (r=0.903, P<0.0001). The level of Gd-IgA1 in IgAN patients (median: 312.5U/ml, interquartile range (IQR) 236.5–407.8U/ml) was significantly higher compared with that of the healthy controls (148.3U/ml, IQR 106.1–209.1U/ml, P<0.001). The patients were next divided into four equal groups according to the quartiles of the Gd-IgA1 distribution; group 1: serum Gd-IgA1 levels <236.5U/ml; group 2: serum Gd-IgA1 between 236.5 and 312.5U/ml; group 3: serum Gd-IgA1 between 312.5 and 407.8U/ml; and Group 4: serum Gd-IgA1 >407.8U/ml. Among cases, we observed no significant association of Gd-IgA1 levels with age, gender, or body mass index (BMI; Table 2). There was a trend for lower eGFR, higher proteinuria, and increased use of immunosuppressives in groups 3 and 4 compared with groups 1 or 2, albeit none of these differences were statistically significant. There were also no significant differences between the groups in the blood pressure control (P=0.96) or proteinuria during follow-up (P=0.94).Table 2Baseline data of clinical features and levels of serum Gd-IgA1 of four groups defined by quartiles of serum Gd-IgA11234U/ml, median (IQR)U/ml, median (IQR)U/ml, median (IQR)U/ml, median (IQR)Group193.9 (158.4, 213.8)272.5 (247.2, 289.0)345.7 (324.2, 369.9)487.4 (438.8, 540.3)P valueNumber69696869Gender (male)41/6937/6933/6836/690.638Age (year)32.78±11.4333.87±10.6332.47±11.331.80±9.340.718Hypertension (%)34 (49.3%)34 (49.3%)27 (39.7%)36 (52.2%)0.488Proteinuria (%, >1g/day)42/69 (60.9%)39/69 (56.5%)50/68 (73.5%)45/69 (65.2%)0.196eGFR (ml/min per 1.73m2), stages 1, 2, 3, and 4 CKD (KDOQI)29/28/10/234/18/16/129/24/13/230/22/13/40.715Histological grading (mild lesions/severe lesions)26/4329/4034/3431/380.525Prednisone27 (39.13%)29 (42.03%)37 (54.41%)34 (49.28%)0.264Any other immunosuppressive agents21 (30.4%)18 (26.1%)16 (23.5%)24 (34.7%)0.481ACE inhibitors or ARBs68 (98.60%)69 (100.0%)66 (97.10%)64 (94.10%)0.157Total IgA (μg/ml, median, IQR)2026 (1566.5,2411)2479 (2309.5,2849)2880 (2362.5,3669)3483 (2855,4012)<0.001Plasma IgA1 (μg/ml, median, IQR)1352.2 (1138.3,1699.7)1574.7 (1325.9,1827.6)1868.8 (1556.8,2289.6)2109.5 (1765.5,2558.6)<0.001Kidney failure events (%)6 (8.69%)6/69 (8.69%)15/68 (22.1%)15/69 (21.7%)0.026Abbreviations: ACE, angiotensin-converting enzyme; ARB, angiotensin II receptor blocker; CKD, chronic kidney disease; eGFR, estimate glomerular filtration rate; Gd-IgA1, galactose-deficient IgA1; IQR, interquartile range.Histological grading was divided into mild lesions and severe lesions group. The former group included Haas I, II, and III, and the latter group included IV and V. Continuous data were compared by one-way analysis of variance test; dichotomous or categorical data were analyzed by χ2 test. Open table in a new tab Abbreviations: ACE, angiotensin-converting enzyme; ARB, angiotensin II receptor blocker; CKD, chronic kidney disease; eGFR, estimate glomerular filtration rate; Gd-IgA1, galactose-deficient IgA1; IQR, interquartile range. Histological grading was divided into mild lesions and severe lesions group. The former group included Haas I, II, and III, and the latter group included IV and V. Continuous data were compared by one-way analysis of variance test; dichotomous or categorical data were analyzed by χ2 test. Baseline clinical and pathological variables were tested for association with the primary progression outcome using Cox proportional hazards model. In univariate analyses, lower baseline eGFR, higher histological grading, greater degree of proteinuria, use of steroids, and higher levels of Gd-IgA1 were all significantly associated with a progression risk, but age, gender, hypertension, hemoglobin, or albumin levels were not (Supplementary Table S1 online). Download .doc (.04 MB) Help with doc files Supplementary Table S1 Unadjusted and multivariable adjusted hazard ratios (HRs) for composite of end point are presented in Table 3 according to baseline Gd-IgA1, expressed as a continuous variable or in quartiles. In adjusted analysis including baseline proteinuria, hypertension, eGFR, Haas classification, and steroid therapy, higher levels of Gd-IgA1 were independently associated with a greater risk of kidney failure (HR, per s.d. of natural log–transformed Gd-IgA1 1.44; 95% confidence interval (CI), 1.11–1.88, P=0.006). Gd-IgA1 level remained strongly associated with progression even after adjustment for time-average proteinuria and other baseline risk factors including hypertension and eGFR (HR=1.39, 95% CI 1.24–1.56, P=1.15 × 10-8). Compared with the first quartile of Gd-IgA1 (reference), the risk of kidney failure increased by quartile of Gd-IgA1 level: the HRs were 2.47 (95% CI, 0.91–6.72) for the second quartile, 3.86 (95% CI, 1.33–11.33) third quartile, and 4.76 (95% CI, 1.61–14.09) fourth quartile.Table 3Risks of composite end-point natural log–transformed Gd-IgA1 and ascending quartilesGd-IgA1, median (range), U/mlUnadjustedHazard ratio (95% confidence interval) and P-valueModel 1aModel 1 adjusted for estimate glomerular filtration rate (eGFR), proteinuria, and hypertension (yes or no). Hypertension (yes or no) was analyzed as dichotomous data.Model 2bModel 2 adjusted for covariates in model 1 plus histological grading (mild and severe lesion group). The latter variable was analyzed as categorical data.Model 3cModel 3 adjusted for covariates in model 2 plus steroid use (yes or no). The latter variable was analyzed as dichotomous data. Composite end point was defined as 50% decline of eGFR (n=29), end-stage renal disease (n=3), or death (n=2). The two deaths also had 50% decline of eGFR. Unadjusted model analyzed Gd-IgA1 as continuous data.Composite end point Per 1s.d. lnGd-IgA1312.5 (89.0–1442.0)2.07 (1.53–2.78)1.51 (1.16–1.97)1.50 (1.15–1.96)1.44 (1.11–1.88)1.68 × 10-60.0020.0030.006Gd-IgA1 quartiles 1193.88 (89.0–237.0)1 (Reference)1 (Reference)1 (Reference)1 (Reference) 2272.51 (239.0–312.0)2.63 (0.94–7.36)2.71 (0.99–7.39)2.73 (0.99–7.45)2.47 (0.91–6.72)0.0660.0520.0510.077 3345.67 (313.0–406.0)4.03(1.36–11.96)3.74 (1.28–10.93)3.72 (1.27–10.89)3.86 (1.33–11.33)0.0120.0160.0160.013 4487.36 (408.0–1442.0)6.76 (2.23–20.19)5.18 (1.75–15.34)5.29 (1.78–15.73)4.76 (1.61–14.09)0.0010.0030.0030.005Abbreviations: Gd-IgA1, galactose-deficient IgA1; lnGd-IgA1, natural log–transformed Gd-IgA1.a Model 1 adjusted for estimate glomerular filtration rate (eGFR), proteinuria, and hypertension (yes or no). Hypertension (yes or no) was analyzed as dichotomous data.b Model 2 adjusted for covariates in model 1 plus histological grading (mild and severe lesion group). The latter variable was analyzed as categorical data.c Model 3 adjusted for covariates in model 2 plus steroid use (yes or no). The latter variable was analyzed as dichotomous data.Composite end point was defined as 50% decline of eGFR (n=29), end-stage renal disease (n=3), or death (n=2). The two deaths also had 50% decline of eGFR. Unadjusted model analyzed Gd-IgA1 as continuous data. Open table in a new tab Abbreviations: Gd-IgA1, galactose-deficient IgA1; lnGd-IgA1, natural log–transformed Gd-IgA1. As shown in Figure 1, the renal survival deteriorated by the quartile of serum Gd-IgA1 level. The renal survival at first and third year in each group of patients was 100.0% and 96.9%; 100.0% and 91.8%; 100.0% and 92.2%; 98.6% and 88.6%, respectively (log-rank test, P=0.004). We also analyzed Gd-IgA1/IgA1 ratio and Gd-IgA1/total IgA ratio instead of Gd-IgA1. Gd-IgA1/IgA1 and Gd-IgA1/IgA ratios also represented risk factors for kidney disease progression in the univariate analysis (unadjusted HR=1.42, 95% CI 1.05–1.92, P=0.021; and HR=1.56, 95% CI 1.15–2.12, P=0.005, respectively) but were not significantly associated after adjustment for other covariates in the multivariate model (P=0.2 and 0.34, respectively). IgAN can have a highly variable course. Some patients progress rapidly to ESRD, whereas others have a rather benign disease trajectory.17.Coppo R. Amore A. Aberrant glycosylation in IgA nephropathy (IgAN).Kidney Int. 2004; 65: 1544-1547Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (152) Google Scholar,18.Novak J. Tomana M. Kilian M. et al.Heterogeneity of O-glycosylation in the hinge region of human IgA1.Mol Immunol. 2000; 37: 1047-1056Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar The individual outcomes of IgAN remain difficult to predict. Previous longitudinal studies have associated proteinuria, hypertension, and impaired renal function at the time of diagnosis with IgAN progression.19.Bartosik L.P. Lajoie G. Sugar L. et al.Predicting progression in IgA nephropathy.Am J Kidney Dis. 2001; 38: 728-735Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (309) Google Scholar In this study, we hypothesize that the increased serum level of Gd-IgA1, the key pathogenic feature in IgAN, causes accelerated disease progression in IgAN. On the basis of the comparison of Gd-IgA1 levels between the IgAN patients and a large group of healthy population controls, our study confirmed that serum Gd-IgA1 levels are elevated in IgAN. Most importantly, our study also demonstrated that high levels of Gd-IgA1 were predictive of renal function decline in IgAN. On the basis of our prospective follow-up data, we found that elevated level of serum Gd-IgA1 was independently associated with increased risk of renal disease progression. Among cases with biopsy-based diagnosis of IgAN, participants with the highest vs. the lowest quartile demonstrated a 4.76-fold greater risk of kidney progression. Thus, our data suggest that high levels of Gd-IgA1 may have prognostic utility in IgAN. Our observations that individuals with higher levels of Gd-IgA1 are more prone to disease progression may justify closer follow-up and possibly more aggressive treatment of such individuals. A recent study from Japan found that Gd-IgA1 was also significantly elevated in Japanese IgAN patients,20.Shimozato S. Hiki Y. Odani H. et al.Serum under-galactosylated IgA1 is increased in Japanese patients with IgA nephropathy.Nephrol Dial Transplant. 2008; 23: 1931-1939Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar however, this study did not examine its impact on kidney disease progression. Another study investigated the impact of Gd-IgA1 levels on the renal function decline rate among 62 Caucasian patients with IgAN.21.Camilla R. Suzuki H. Dapra V. et al.Oxidative stress and galactose-deficient IgA1 as markers of progression in IgA nephropathy.Clin J Am Soc Nephrol. 2011; 6: 1903-1911Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar Gd-IgA1 was independently associated with proteinuria level during the follow-up. Although Gd-IgA1 by itself was not associated with the rate of GFR decline, the combination of a high level of Gd-IgA1 and advanced oxidation protein products contributed to a more rapid loss of renal function. However, the small sample size was the major limitation of the prior studies. Taken together, these studies suggest that aberrant glycosylation of IgA1 contributes to the risk of nephropathy in both Chinese and Caucasian populations. Both in vivo and in vitro studies have now firmly established that altered O-glycosylation of serum IgA1 has a central role in the development of IgAN.22.Barratt J. Smith A.C. Feehally J. The pathogenic role of IgA1 O-linked glycosylation in the pathogenesis of IgA nephropathy.Nephrology. 2007; 12: 275-284Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 23.Tam K.Y. Leung J.C. Chan L.Y. et al.Macromolecular IgA1 taken from patients with familial IgA nephropathy or their asymptomatic relatives have higher reactivity to mesangial cells in vitro.Kidney Int. 2009; 75: 1330-1339Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (32) Google Scholar, 24.Novak J. Tomana M. Matousovic K. et al.IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy differentially affect proliferation of mesangial cells.Kidney Int. 2005; 67: 504-513Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (173) Google Scholar Novak et al. have demonstrated that B-cell abnormal expression/activity of enzymes involved in sialylation and/or galactosylation of the IgA1 hinge region O-linked glycans underlie this defect. Furthermore, anti-glycan antibodies (IgG and/or IgA1) recognize Gd-IgA1 (auto-antigen) and trigger the formation of IgA1-containing immune complexes.5.Suzuki H. Fan R. Zhang Z. et al.Aberrantly glycosylated IgA1 in IgA nephropathy patients is recognized by IgG antibodies with restricted heterogeneity.J Clin Invest. 2009; 119: 1668-1677PubMed Google Scholar In addition, it appears that the defect in the glycosylation of IgA1 is, to a large degree, genetically determined.25.Gharavi A.G. Moldoveanu Z. Wyatt R.J. et al.Aberrant IgA1 glycosylation is inherited in familial and sporadic IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2008; 19: 1008-1014Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar, 26.Kiryluk K. Moldoveanu Z. Sanders J.T. et al.Aberrant glycosylation of IgA1 is inherited in both pediatric IgA nephropathy and Henoch-Schonlein purpura nephritis.Kidney Int. 2011; 80: 79-87Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (169) Google Scholar, 27.Lin X. Ding J. Zhu L. et al.Aberrant galactosylation of IgA1 is involved in the genetic susceptibility of Chinese patients with IgA nephropathy.Nephrol Dial Transplant. 2009; 24: 3372-3375Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar However, this IgA1 O-glycosylation aberrancy (Hit 1) itself is not sufficient to induce renal injury.25.Gharavi A.G. Moldoveanu Z. Wyatt R.J. et al.Aberrant IgA1 glycosylation is inherited in familial and sporadic IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2008; 19: 1008-1014Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar Synthesis and binding of antibodies directed against Gd-IgA1 are required for the formation of immune complexes that accumulate in the glomerular mesangium (Hits 2).28.Suzuki H. Kiryluk K. Novak J. et al.The pathophysiology of IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2011; 22: 1795-1803Crossref PubMed Scopus (465) Google Scholar On the basis of the results of this study, we speculate that a higher level of circulating Gd-IgA1, when exposed to the second hit, may result in more severe kidney injury. The limitations of our study include the relatively short follow-up, with a median of ∼4 years. This reduces the study power, with fewer end points observed during this time period. We used a composite end point of 50% decline from baseline eGFR, ESRD, or death, which is a robust outcome used in many clinical trials.29.Manno C. Torres D.D. Rossini M. et al.Randomized controlled clinical trial of corticosteroids plus ACE-inhibitors with long-term follow-up in proteinuric IgA nephropathy.Nephrol Dial Transplant. 2009; 24: 3694-3701Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar Future extension of this study to a follow-up period that exceeds 10 years would enable examination of harder end points (such as ESRD alone) and provide more accurate effect estimates. Other limitations stem from the complicated multistep ELISA assay used in this study to quantify Gd-IgA1 levels. This method may not be ideal for accurate detection of small differences in Gd-IgA1 levels. Mass spectrometry–based methods, such as those30.Wada Y. Dell A. Haslam S.M. et al.Comparison of methods for profiling O-glycosylation: Human Proteome Organisation Human Disease Glycomics/Proteome Initiative multi-institutional study of IgA1.Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 719-727Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar, 31.Takahashi K. Wall S.B. Suzuki H. et al.Clustered O-glycans of IgA1: defining macro- and microheterogeneity by use of electron capture/transfer dissociation.Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 2545-2557Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 32.Takahashi K. Smith A.D. Poulsen K. et al.Naturally ocurring structural isomers in serum IgA1 hinge-region O-glycosylation.J Proteome Res. 2011; 11: 692-702Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar, 33.Wada Y. Tajiri M. Ohshima S. Quantitation of saccharide compositions of O-glycans by mass spectrometry of glycopeptides and its application to rheumatoid arthritis.J Proteome Res. 2010; 9: 1367-1373Crossref PubMed Scopus (53) Google Scholar developed recently may be more appropriate future approaches. In addition, the observed distribution of serum Gd-IgA1 levels deviates from normality and is positively skewed. To circumvent this problem, we used quartiles of Gd-IgA1 levels in our regression analyses. Finally, we recognize that our results may not be applicable to all patient populations, as our study cohort consists of only Han Chinese patients followed at a single tertiary care medical center. Additional longitudinal studies of more diverse patient cohorts are needed to validate our findings. Patients with IgAN are characterized by a highly variable clinical course ranging from a totally benign incidental condition to rapidly progressive renal failure. Many studies have focus on predicting outcomes in IgAN from the baseline clinical or pathological variables.19.Bartosik L.P. Lajoie G. Sugar L. et al.Predicting progression in IgA nephropathy.Am J Kidney Dis. 2001; 38: 728-735Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (309) Google Scholar, 20.Shimozato S. Hiki Y. Odani H. et al.Serum under-galactosylated IgA1 is increased in Japanese patients with IgA nephropathy.Nephrol Dial Transplant. 2008; 23: 1931-1939Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar, 34.Berthoux F. Mohey H. Laurent B. et al.Predicting the risk for dialysis or death in IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol. 2011; 22: 752-761Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar, 35.Goto M. Wakai K. Kawamura T. et al.A scoring system to predict renal outcome in IgA nephropathy: a nationwide 10-year prospective cohort study.Nephrol Dial Transplant. 2009; 24: 3068-3074Crossref PubMed Scopus (182) Google Scholar, 36.Manno C. Strippoli G.F. D’Altri C. et al.A novel simpler histological classification for renal survival in IgA nephropathy: a retrospective study.Am J Kidney Dis. 2007; 49: 763-775Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (124) Google Scholar, 37.Cattran D.C.

Abstract Aberrant O -glycosylation of serum immunoglobulin A1 (IgA1) represents a heritable pathogenic defect in IgA nephropathy, the most common form of glomerulonephritis worldwide, but specific genetic factors involved in its determination are not known. We performed a quantitative GWAS for serum levels of galactose-deficient IgA1 (Gd-IgA1) in 2,633 subjects of European and East Asian ancestry and discovered two genome-wide significant loci, in C1GALT1 (rs13226913, P = 3.2 × 10 −11 ) and C1GALT1C1 (rs5910940, P = 2.7 × 10 −8 ). These genes encode molecular partners essential for enzymatic O -glycosylation of IgA1. We demonstrated that these two loci explain approximately 7% of variability in circulating Gd-IgA1 in Europeans, but only 2% in East Asians. Notably, the Gd-IgA1-increasing allele of rs13226913 is common in Europeans, but rare in East Asians. Moreover, rs13226913 represents a strong cis-eQTL for C1GALT1, which encodes the key enzyme responsible for the transfer of galactose to O -linked glycans on IgA1. By in vitro siRNA knock-down studies, we confirmed that mRNA levels of both C1GALT1 and C1GALT1C1 determine the rate of secretion of Gd-IgA1 in IgA1-producing cells. Our findings provide novel insights into the genetic regulation of O -glycosylation and are relevant not only to IgA nephropathy, but also to other complex traits associated with O -glycosylation defects, including inflammatory bowel disease, hematologic disease, and cancer. Author Summary O -glycosylation is a common type of post-translational modification of proteins; specific abnormalities in the mechanism of O -glycosylation have been implicated in cancer, inflammatory and blood diseases. However, the molecular basis of abnormal O -glycosylation in these complex disorders is not known. We studied the genetic basis of defective O -glycosylation of serum Immunoglobulin A1 (IgA1), which represents the key pathogenic defect in IgA nephropathy, the most common form of primary glomerulonephritis worldwide. We report our results of the first genome-wide association study for this trait using serum assays in 2,633 individuals of European and East Asian ancestry. In our genome scan, we observed two significant signals with large effects, on chromosomes 7p21.3 and Xq24, jointly explaining about 7% of trait variability. These signals implicate two genes that encode molecular partners essential for enzymatic O -glycosylation of IgA1 and mucins, and represent potential new targets for therapy.

N-glycans, which represent >50% mass of the HIV-1 envelope (Env) trimer, play important roles for virus-cell entry and immune evasion. How each glycan unit interacts to shape the Env protein-sugar complex and affects Env function is not well understood. Here, high-resolution glycomics analysis of two Env variants from the same donor, with differing functional characteristics and N-glycosylation-site composition, revealed that changes to key N-glycosylation-site not only affected the Env structure at distant locations, but also had a ripple effect on Env-wide glycan processing, virus infectivity, and antibody recognition and virus neutralization. Specifically, the N262 glycan, although not located in the CD4-binding site, controlled Env binding to the CD4 receptor, affected the recognition of Env by several glycan-dependent broadly neutralizing antibodies, and altered heterogeneity of glycosylation at several sites, with N156, N160, and N448 displaying limited glycan processing. Molecular dynamic simulations visualized how specific oligosaccharide positions can move to compensate for loss of a glycan. This study demonstrates how changes in individual glycan units can alter molecular dynamics and processing of the Env-glycan shield and, consequently, Env function.