(Cell Stem Cell 15, 169–184; August 7, 2014) A reader has pointed out that, in Figure 4C and Figure 6G of our originally published manuscript, there is apparent duplication of some of the plots presented. Upon examination of the affected panels and the underlying original data, we discovered that in both instances there is indeed duplication resulting from inclusion of erroneous image files. In Figure 4C, the Gr1/Ter119 flow profile presented for the control nonanemic condition (PHZ−, 2-DG−, DON−) in the lower panel is a duplication of the profile for the PHZ+, 2-DG+, DON− condition, although the indicated gated percentages do correspond to the correct original data. We have corrected the figure by replacing the profile in the control panel with the correct data. In Figure 6G, the histograms presented for CD71 staining in the DON and DON + DMK conditions are inadvertent duplications of the corresponding histograms for CD36, shown immediately below. To correct this figure, we have replaced the indicated panels with the correct data for the CD71 staining. In both figures, all panels other than those specifically highlighted remain the same. These unfortunate oversights in figure assembly do not affect our underlying data or conclusions. We apologize for any confusion that these issues have caused, and we wish to thank the anonymous reader for bringing them to our attention. The corrected figures are presented below and have been replaced in the versions of the manuscript that are available online.Figure 6Glutamine-Dependent Nucleotide Biosynthesis Is a Rate-Limiting Step in EPO-Induced Erythroid Differentiation of Human Hematopoietic ProgenitorsView Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) Glucose and Glutamine Metabolism Regulate Human Hematopoietic Stem Cell Lineage SpecificationOburoglu et al.Cell Stem CellJune 19, 2014In BriefMetabolite availability regulates stem cell differentiation, influencing lineage decisions during periods of in vivo metabolic stress. Oburoglu et al. show that erythroid differentiation requires glucose and glutamine metabolism and that HSCs are diverted to a myelomonocytic fate under restrictive conditions. Full-Text PDF Open Archive

Members of the TRIM protein family have been shown to gather into structures in both the nucleus and cytoplasm. One TRIM protein family member, TRIM5α, has been shown to form cytoplasmic bodies involved in restricting retroviruses such as HIV-1. Here we applied cryogenic correlated light and electron microscopy (cryo-CLEM) to intact mammalian cells expressing YFP-rhTRIM5α and found hexagonal nets were present whose arm-lengths were similar to those of the hexagonal nets formed by purified TRIM5α in-vitro. We also observed YFP-rhTRIM5α within a diversity of structures with characteristics expected for organelles involved in different stages of macroautophagy, including disorganized protein aggregations (sequestosomes), sequestosomes flanked by flat double-membraned vesicles (sequestosome:phagophore complexes), sequestosomes within a double-membraned vesicle (autophagosomes), and sequestosomes within multi-vesicular autophagic vacuoles (autolysosomes or amphisomes). Vaults were also seen in these structures, consistent with their role in autophagy. Our data (i) support recent reports that TRIM5α can form both well-organized signaling complexes and non-signaling aggregates, (ii) offer the first images of the macroautophagy pathway in a near-native state, and (iii) reveal that vaults arrive early in macroautophagy.

Cryogenic correlated light and electron microscopy (cryo-CLEM) is a valuable tool for studying biological processes in situ. In cryo-CLEM, a target protein of interest is tagged with a fluorophore and the location of the corresponding fluorescent signal is used to identify the structure in low-contrast but feature-rich cryo-EM images. To date, cryo-CLEM studies of mammalian cells have relied on very bright organic dyes or fluorescent protein tags concentrated in virus particles. Here we describe a method to expand the application of cryo-CLEM to cells harboring genetically-encoded fluorescent proteins. We discovered that a variety of mammalian cells exhibit strong punctate autofluorescence when imaged under cryogenic conditions (80K). Compared to fluorescent protein tags, these sources of autofluorescence exhibit a broader spectrum of fluorescence, which we exploited to develop a simple, robust approach to discriminate between the two. We validate this method in INS-1E cells using a mitochondrial marker, and apply it to study the ultrastructural variability of secretory granules in a near-native state within intact INS-1E pancreatic cells by high-resolution 3D electron cryotomography.

SUMMARY Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is a primary sensor of aberrant DNA that governs an innate immune signaling cascade, leading to the induction of the type-I interferon response. We have previously identified polyglutamine binding protein 1, PQBP1, as an adaptor molecule required for cGAS-mediated innate immune response of lentiviruses, including the human immunodeficiency virus 1 (HIV-1), but dispensable for the recognition of DNA viruses. HIV-1- encoded DNA is synthesized as a single copy from its RNA genome, and is subsequently integrated into the host chromatin. HIV-1 then produces progeny through amplification and packaging of its RNA genome, thus, in contrast to DNA viruses, HIV-1 DNA is both transient and of low abundance. However, the molecular basis for the detection and verification of this low abundance HIV-1 DNA pathogen-associated molecular pattern (PAMP) is not understood. Here, we elucidate a two-factor authentication strategy that is employed by the innate immune surveillance machinery to selectively respond to the low concentration of PAMP, while discerning these species from extranuclear DNA molecules. We find that, upon HIV-1 infection, PQBP1 decorates intact viral capsid, which serves as a primary verification step for the viral nucleic acid cargo. As the reverse transcription and capsid disassembly initiate, cGAS protein is then recruited to the capsid in a PQBP1-dependent manner, enabling cGAS molecules to be co-positioned at the site of PAMP generation. Thus, these data indicate that PQBP1 recognition of the HIV-1 capsid sanctions a robust cGAS-dependent response to a limited abundance and short-lived DNA PAMP. Critically, this illuminates a molecular strategy wherein the modular recruitment of co-factors to germline encoded pattern recognition receptors (PRRs) serves to enhance repertoire of pathogens that can be sensed by the innate immune surveillance machinery.

Abstract Cerebral organoids (COs) are a valuable tool to study the intricate interplay between glial cells and neurons in brain development and disease, including HIV-associated neuroinflammation. We developed a novel approach to generate microglia containing COs (CO-iMs) by co-culturing hematopoietic progenitors and induced pluripotent stem cells. This approach allowed for the differentiation of microglia within the organoids concomitantly to the neuronal progenitors. CO- iMs exhibited higher efficiency in generation of CD45 + /CD11b + /Iba-1 + microglia cells compared to conventional COs with physiologically relevant proportion of microglia (∼7%). CO-iMs exhibited substantially higher expression of microglial homeostatic and sensome markers as well as markers for the complement cascade. CO-iMs showed susceptibility to HIV infection resulting in a significant increase in several pro-inflammatory cytokines/chemokines and compromised neuronal function, which were abrogated by addition of antiretrovirals. Thus, CO-iM is a robust model to decipher neuropathogenesis, neurological disorders, and viral infections of brain cells in a 3D culture system.