The role of Fat Mass and Obesity-associated protein (FTO) and its substrate N6-methyladenosine (m6A) in mRNA processing and adipogenesis remains largely unknown. We show that FTO expression and m6A levels are inversely correlated during adipogenesis. FTO depletion blocks differentiation and only catalytically active FTO restores adipogenesis. Transcriptome analyses in combination with m6A-seq revealed that gene expression and mRNA splicing of grouped genes are regulated by FTO. M6A is enriched in exonic regions flanking 5′- and 3′-splice sites, spatially overlapping with mRNA splicing regulatory serine/arginine-rich (SR) protein exonic splicing enhancer binding regions. Enhanced levels of m6A in response to FTO depletion promotes the RNA binding ability of SRSF2 protein, leading to increased inclusion of target exons. FTO controls exonic splicing of adipogenic regulatory factor RUNX1T1 by regulating m6A levels around splice sites and thereby modulates differentiation. These findings provide compelling evidence that FTO-dependent m6A demethylation functions as a novel regulatory mechanism of RNA processing and plays a critical role in the regulation of adipogenesis.

FTO, the first RNA demethylase discovered, mediates the demethylation of internal N6-methyladenosine (m6A) and N6, 2-O-dimethyladenosine (m6Am) at the +1 position from the 5' cap in mRNA. Here we demonstrate that the cellular distribution of FTO is distinct among different cell lines, affecting the access of FTO to different RNA substrates. We find that FTO binds multiple RNA species, including mRNA, snRNA, and tRNA, and can demethylate internal m6A and cap m6Am in mRNA, internal m6A in U6 RNA, internal and cap m6Am in snRNAs, and N1-methyladenosine (m1A) in tRNA. FTO-mediated demethylation has a greater effect on the transcript levels of mRNAs possessing internal m6A than the ones with cap m6Am in the tested cells. We also show that FTO can directly repress translation by catalyzing m1A tRNA demethylation. Collectively, FTO-mediated RNA demethylation occurs to m6A and m6Am in mRNA and snRNA as well as m1A in tRNA.

Two human demethylases, the fat mass and obesity-associated (FTO) enzyme and ALKBH5, oxidatively demethylate abundant N6-methyladenosine (m6A) residues in mRNA. Achieving a method for selective inhibition of FTO over ALKBH5 remains a challenge, however. Here, we have identified meclofenamic acid (MA) as a highly selective inhibitor of FTO. MA is a non-steroidal, anti-inflammatory drug that mechanistic studies indicate competes with FTO binding for the m6A-containing nucleic acid. The structure of FTO/MA has revealed much about the inhibitory function of FTO. Our newfound understanding, revealed herein, of the part of the nucleotide recognition lid (NRL) in FTO, for example, has helped elucidate the principles behind the selectivity of FTO over ALKBH5. Treatment of HeLa cells with the ethyl ester form of MA (MA2) has led to elevated levels of m6A modification in mRNA. Our collective results highlight the development of functional probes of the FTO enzyme that will (i) enable future biological studies and (ii) pave the way for the rational design of potent and specific inhibitors of FTO for use in medicine.

The human obesity susceptibility gene, FTO , encodes a protein that is homologous to the DNA repair AlkB protein. The AlkB family proteins utilize iron(II), α‐ketoglutarate (α‐KG) and dioxygen to perform oxidative repair of alkylated nucleobases in DNA and RNA. We demonstrate here the oxidative demethylation of 3‐methylthymine (3‐meT) in single‐stranded DNA (ssDNA) and 3‐methyluracil (3‐meU) in single‐stranded RNA (ssRNA) by recombinant human FTO protein in vitro. Both human and mouse FTO proteins preferentially repair 3‐meT in ssDNA over other base lesions tested. They showed negligible activities against 3‐meT in double‐stranded DNA (dsDNA). In addition, these two proteins can catalyze the demethylation of 3‐meU in ssRNA with a slightly higher efficiency over that of 3‐meT in ssDNA, suggesting that methylated RNAs are the preferred substrates for FTO.

N6-methyladenosine is a prevalent internal modification in messenger RNA and non-coding RNA affecting various cellular pathways. Here we report the discovery of two additional modifications, N6-hydroxymethyladenosine (hm6A) and N6-formyladenosine (f6A), in mammalian messenger RNA. We show that FeII- and α-ketoglutarate-dependent fat mass and obesity-associated (FTO) protein oxidize N6-methyladenosine to generate N6-hydroxymethyladenosine as an intermediate modification, and N6-formyladenosine as a further oxidized product. N6-hydroxymethyladenosine and N6-formyladenosine have half-life times of ~3 h in aqueous solution under physiological relevant conditions, and are present in isolated messenger RNA from human cells as well as mouse tissues. These previously unknown modifications derived from the prevalent N6-methyladenosine in messenger RNA, formed through oxidative RNA demethylation, may dynamically modulate RNA–protein interactions to affect gene expression regulation. Internal modifications in mRNA and non-coding RNA are necessary for modulating various intracellular signalling pathways. In this study, the authors report novel modifications resulting from oxidative RNA demethylation, which regulate RNA–protein interactions affecting gene expression.

Recent discoveries of reversible N6-methyladenosine (m6A) methylation on messenger RNA (mRNA) and mapping of m6A methylomes in mammals and yeast have revealed potential regulatory functions of this RNA modification. In plants, defects in m6A methyltransferase cause an embryo-lethal phenotype, suggesting a critical role of m6A in plant development. Here, we profile m6A transcriptome-wide in two accessions of Arabidopsis thaliana and reveal that m6A is a highly conserved modification of mRNA in plants. Distinct from mammals, m6A in A. thaliana is enriched not only around the stop codon and within 3′-untranslated regions, but also around the start codon. Gene ontology analysis indicates that the unique distribution pattern of m6A in A. thaliana is associated with plant-specific pathways involving the chloroplast. We also discover a positive correlation between m6A deposition and mRNA abundance, suggesting a regulatory role of m6A in plant gene expression. Modification of mRNA with N6-methyladenosine (m6A) is proposed to regulate transcript stability. Here, Jia et al. uncover plant-specific features in the m6A methylome of Arabidopsis, such as methylation enrichment around the start codon, and suggest a positive role in gene expression.