Various kinds of fatty acids are distributed in membrane phospholipids in mammalian cells and tissues. The degree of fatty acid unsaturation in membrane phospholipids affects many membrane-associated functions and can be influenced by diet and by altered activities of lipid-metabolizing enzymes such as fatty acid desaturases. However, little is known about how mammalian cells respond to changes in phospholipid fatty acid composition. In this study we showed that stearoyl-CoA desaturase 1 (SCD1) knockdown increased the amount of saturated fatty acids and decreased that of monounsaturated fatty acids in phospholipids without affecting the amount or the composition of free fatty acid and induced unfolded protein response (UPR), evidenced by increased expression of C/EBP homologous protein (CHOP) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) mRNAs and splicing of Xbox-binding protein 1 (XBP1) mRNA. SCD1 knockdown-induced UPR was rescued by various unsaturated fatty acids and was enhanced by saturated fatty acid. Lysophosphatidylcholine acyltransferase 3 (LPCAT3), which incorporates preferentially polyunsaturated fatty acids into phosphatidylcholine, was up-regulated in SCD1 knockdown cells. Knockdown of LPCAT3 synergistically enhanced UPR with SCD1 knockdown. Finally we showed that palmitic acid-induced UPR was significantly enhanced by LPCAT3 knockdown as well as SCD1 knockdown. These results suggest that a decrease in membrane phospholipid unsaturation induces UPR.

Intraluminal pressure elevation can cause degenerative disorders, such as ileus and hydronephrosis, and the threshold is fairly low and constant, 20−30 cm H2O. We previously devised a novel two−chamber culture system subjecting cells cultured on a semipermeable membrane to increased culture medium height (water pressure up to 60 cm H2O). Here, we cultured several different cell lines using the low static pressure−loadable two−chamber system, and examined cell growth, cell cycle, and cell morphology. Madin−Darby canine kidney (MDCK) columnar epithelial cells were growth−suppressed in a manner dependent on static water pressure ranging from 2−50 cm H2O, without cell cycle arrest at any specific phase. Two other types of columnar epithelial cells exhibited similar phenotypes. By contrast, spherical epithelial and mesenchymal cells were not growth−suppressed, even at 50 cm H2O. Phalloidin staining revealed that 50 cm H2O pressure load vertically flattened and laterally widened columnar epithelial cells and made actin fiber distribution sparse, without affecting total phalloidin intensity per cell. When the mucosal protectant irsogladine maleate (100 nM) was added to 50−cm−high culture medium, MDCK cells were reduced in volume and their doubling time shortened. Cell proliferation and morphology are known to be regulated by the Hippo signaling pathway, but a pressure load of 50 cm H2O did not alter the expression levels of Hippo signaling molecules in columnar epithelial cells, suggesting that this pathway was not involved in the pressure−induced phenotypes. RNA sequencing of MDCK cells showed that a 50 cm H2O pressure load upregulated keratin 14, an intermediate filament, 12−fold. This upregulation was confirmed at the protein level by immunofluorescence, suggesting a role in cytoskeletal reinforcement. These results provide evidence that cell morphology and the cytoskeleton are closely linked to cell growth. Pathological intraluminal pressure elevation may cause mucosal degeneration by acting directly on this linkage.

Recent advances in the clinical development of oligonucleotide therapeutics, such as antisense oligonucleotides (ASOs) and small interfering RNAs, have attracted attention as promising therapeutic modalities for genetic and intractable diseases. These oligonucleotide therapeutics exert their efficacy by binding to target RNAs present within cells; however, the mechanisms underlying their cellular uptake, especially their passage through membranes, remain largely unclear. In the nematode, Caenorhabditis elegans, the multi-pass transmembrane protein, SID-1, is involved in the cellular uptake of double-stranded RNAs. In mammals, SIDT1 and SIDT2 (SID-1 transmembrane family, members 1 and 2, respectively) are homologs of SID-1, yet their functional differences are not fully understood. In this study, we conducted a comparative analysis of the amino acid sequences of mammalian SIDT1 and SIDT2 to identify regions characteristic to each. By inducing SIDT1 or SIDT2 expression in human cell lines, we demonstrated that SIDT2 enhanced the knockdown activity of gapmer ASOs and potentially promoted their endosomal escape into the cytosol. Furthermore, by analyzing chimeric proteins of SIDT2 and SIDT1, we identified a region in SIDT2 that might be crucial for the enhancement of gapmer ASO activity. These findings elucidate the novel role of SIDT2 in the transport mechanism of gapmer ASOs and are expected to contribute to further development of oligonucleotide therapeutics.