Plant respiratory burst oxidase homolog (rboh) proteins, which are homologous to the mammalian 91-kDa glycoprotein subunit of the phagocyte oxidase (gp91^phox) or NADPH oxidase 2 (NOX2), have been implicated in the production of reactive oxygen species (ROS) both in stress responses and during development. Unlike mammalian gp91^phox/NOX2 protein, plant rboh proteins have hydrophilic N-terminal regions containing two EF-hand motifs, suggesting that their activation is dependent on Ca²⁺. However, the significance of Ca²⁺ binding to the EF-hand motifs on ROS production has been unclear. By employing a heterologous expression system, we showed that ROS production by Arabidopsis thaliana rbohD (AtrbohD) was induced by ionomycin, which is a Ca²⁺ ionophore that induces Ca²⁺ influx into the cell. This activation required a conformational change in the EF-hand region, as a result of Ca²⁺ binding to the EF-hand motifs. We also showed that AtrbohD was directly phosphorylated in vivo, and that this was enhanced by the protein phosphatase inhibitor calyculin A (CA). Moreover, CA itself induced ROS production and dramatically enhanced the ionomycin-induced ROS production of AtrbohD. Our results suggest that Ca²⁺ binding and phosphorylation synergistically activate the ROS-producing enzyme activity of AtrbohD.

Azole resistance in Aspergillus fumigatus is predominantly associated with increased expression of Cyp51A (lanosterol 14α-demethylase), the target enzyme of azole antifungal agents, or with single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in cyp51A. Although several SNPs that may be linked to low susceptibility in azole-resistant isolates have previously been reported, few studies have been conducted to conclusively demonstrate the contribution of SNPs to decreased azole susceptibility. An A. fumigatus strain was isolated from the sputum of a 74-year-old male receiving long-term voriconazole treatment for chronic progressive pulmonary aspergillosis. Etest antifungal susceptibility testing showed low susceptibility to voriconazole, itraconazole, and posaconazole. Nucleotide sequencing of cyp51A from this isolate revealed the mutations Gly138Ser (GGC→AGC) and Asn248Lys (AAT→AAA) compared with the cyp51A of azole-susceptible isolates. PCR-amplified DNA fragments containing cyp51A with or without the mutations of interest and a hygromycin marker were simultaneously introduced along with the Cas9 protein and in vitro-synthesized single-guide RNA into protoplasts of the azole-resistant/susceptible strains. Etest azole susceptibility testing of recombinant strains showed an increased susceptibility via the replacement of Ser138 by glycine. In contrast, azole susceptibility was slightly decreased when a Ser138 mutation was introduced into the azole-susceptible strain AfS35, indicating that the serine at position 138 of Cyp51A contributes to low susceptibility in the azole-resistant isolate. Genetic recombination, which has been hampered thus far in clinical isolates, can now be achieved using Cas9/CRISPR genome editing. This technique could be useful to investigate the contribution of other SNPs of cyp51A to azole resistance.