ABSTRACT BACKGROUND Non-muscle-invasive bladder cancer (NMIBC) poses clinical challenges due to its high recurrence and progression rates. While Bacillus Calmette-Guérin (BCG) remains as the gold standard treatment for high-risk NMIBC, recent irruption of anti-PD-1/PD-L1 drugs claims for a comprehensive understanding of the tumour microenvironment (TME) of these tumors. METHODS The present prospective study consisted on the analysis 98 fresh NMIBC samples, tumor and non-pathological tissue, via flow cytometry. Final analysis included distribution of 11 cell types and the expression of PD-L1 in 66 tumor and 62 non-pathological tissue biopsies from 73 NMIBC patients (84.4% paired samples). The results were validated using publicly available transcriptomic data, and histology. RESULTS In comparison to non-pathological tissue, the TME of NMIBC presented microvascular alterations, increased cancer-associated fibroblast (CAF) and myofibroblast (myoCAF) presence, and varied immune cell distribution. Heterogeneous PD-L1 expression was observed across subsets, with cancer cells as primary potential anti-PD-L1 binding targets. Unbiased analysis revealed that myoCAF and M2-like macrophages are enriched in high grade NMIBC tumors, but only myoCAF were associated with higher rates of progression and recurrence, as we confirmed in three independent transcriptomic cohorts (888 total patients). We further validated the prognostic value of myoCAFs by tissue micro-array. CONCLUSION This comprehensive analysis provides a roadmap to establish the full landscape of the NMIBĆs TME, highlighting myoCAFs as potential prognostic markers. FUNDING This study was funded by FC AECC (INVES222946GARC), Consejería de Educación, Ciencia y Universidades de la CAM (2018-T2/BMD-10342), Hoffmann-La Roche, Ministerio de Ciencia e Innovación (INMUNOEPIBLA) and ISCIII/FEDER (CIBERONC CB16/12/00489)

The promising ability to genetically modify hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) by precise gene editing remains challenging due to their sensitivity and poor permissiveness. This represents the first evidence of implementing a gene editing strategy in a murine safe harbor locus that phenotypically corrects primary cells derived from a mouse model of Fanconi anemia (FA). By co-delivering TALENs and a donor therapeutic FANCA cassette template to the Mbs85 locus (ortholog of the hAAVS1 safe harbor locus), we achieved efficient gene targeting (23%) in FA mouse embryonic fibroblasts (MEFs). This resulted in the phenotypic correction of these cells, as revealed by the improvement of their hypersensitivity to mitomycinC. Moreover, robust evidence of targeted integration was observed in murine WT and FA-A hematopoietic progenitor cells (HPC) reaching mean targeted integration values of 20.98% and 16.33% respectively, with phenotypic correction of FA HPCs. Overall, our results demonstrate the feasibility of implementing a therapeutic targeted integration strategy in a murine safe harbor locus, such as the Mbs85 gene, of MEFs and murine HPC from a FA mouse model.

Development of advanced gene and cell therapies for the treatment of genetic diseases requires confident animal and cellular models to test their efficacy and is crucial in the cases where no primary samples from patients are available. CRISPR/Cas9 technology, has become one of the most spread endonuclease tools for editing the genome at will. Moreover, it is known that the use of two guides tends to produce the precise deletion between the guides via NHEJ. Different distances between guides were tested (from 8 to 500 base pairs). We found that distances between the two cutting sites and orientation of Cas9 protein-DNA interaction are important for the efficiency within the optimal range (30-60 bp), we could obtain new genetically reproducible models for two rare disease, a Pyruvate Kinase Deficiency model, using human primary cells, and a (for in vivo primary hyperoxaluria therapeutic mouse model. We demonstrate that the use of a 2-guideRNAs at the optimal distance and orientation is a powerful strategy for disease modelling in those diseases where the availability of primary cells is limited.

ABSTRACT Pyruvate Kinase Deficiency (PKD) is an autosomal recessive disorder caused by mutations in the PKLR gene, which constitutes the main cause of chronic non-spherocytic hemolytic anemia. PKD incidence is estimated in 1 in 20,000 people worldwide. The PKLR gene encodes for the erythroid pyruvate kinase protein (RPK) implicated in the last step of the anaerobic glycolysis in red blood cells. The defective enzyme fails to maintain normal erythrocyte ATP levels, producing severe hemolytic anemia, and can be fatal in severe patients. The only curative treatment for PKD is allogeneic hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) transplantation, so far. However, HSPC transplant is associated with a significant morbidity and mortality, especially in PKD patients. Here, we address the correction of PKD through precise gene editing at the PKLR endogenous locus to keep the tight regulation of RPK enzyme during erythropoiesis. We combined CRISPR/Cas9 system and rAAVs for donor matrix delivery to build an efficient and safe system to knock-in a therapeutic donor at the translation start site of the RPK isoform in human hematopoietic progenitors. Edited human hematopoietic progenitors efficiently reconstituted human hematopoiesis in primary and secondary immunodeficient recipient mice. Moreover, erythroid cells derived from edited PKD-HSPCs restored normal levels of ATP, demonstrating the restoration of RPK function in PKD erythropoiesis after gene editing. Our gene editing strategy may represent a lifelong therapy to restore RPK functionality in RBCs of patients and correct PKD. Single Sentence Summary Clinically relevant gene editing in hematopoietic stem cells for the treatment of Pyruvate Kinase Deficiency.