His-tag affinity purification is one of the most commonly used methods to purify recombinant proteins expressed in E. coli. One drawback of using the His-tag is the co-purification of contaminating histidine-rich E. coli proteins. We engineered a new E. coli expression strain, LOBSTR (low background strain), which eliminates the most abundant contaminants. LOBSTR is derived from the E. coli BL21(DE3) strain and carries genomically modified copies of arnA and slyD, whose protein products exhibit reduced affinities to Ni and Co resins, resulting in a much higher purity of the target protein. The use of LOBSTR enables the pursuit of challenging low-expressing protein targets by reducing background contamination with no additional purification steps, materials, or costs, and thus pushes the limits of standard His-tag purifications.

Switching perception of friend and foe Lysine motif receptors in plants perceive glycans that signal the presence of pathogenic or symbiotic nitrogen-fixing microbes. Bozsoki et al. now define the portions of these receptors that create the discriminatory binding pocket (see the Perspective by Bisseling and Geurts). The motifs were conserved in receptors that initiate immune responses, reflecting the invariable nature of the chitin fragments that they sense. Conversely, the motifs in receptors that respond to symbiotic signals were more varied, reflecting the greater diversity of the lipochitooligosaccharides (Nod factors) that they sense. With domain swapping, the authors switched the Nod factor specificity of receptors from two legume species and also enabled a chitin receptor that was otherwise dedicated to the detection of pathogenic microbes to instead recognize Nod factors. Science , this issue p. 663 ; see also p. 620

Plants adapt to fluctuating environmental conditions by adjusting their metabolism and gene expression to maintain fitness

Abstract Legume-rhizobium signaling during establishment of symbiotic nitrogen fixation restricts rhizobium colonization to specific cells. A limited number of root hair cells allow infection threads to form, and only a fraction of the epidermal infection threads progress to cortical layers to establish functional nodules. Here we use single-cell analysis to define the epidermal and cortical cell populations that respond to and facilitate rhizobium infection. We then identify high-confidence nodulation gene candidates based on their specific expression in these populations, pinpointing genes stably associated with infection across genotypes and time points. We show that one of these, which we name SYMRKL1 , encodes a protein with an ectodomain predicted to be nearly identical to that of SYMRK and is required for normal infection thread formation. Our work disentangles cellular processes and transcriptional modules that were previously confounded due to lack of cellular resolution, providing a more detailed understanding of symbiotic interactions.

Abstract Nuclear pore complexes (NPCs) are the main conduits for molecular exchange across the nuclear envelope. The NPC is a modular assembly of ~500 individual proteins, called nucleoporins or nups. Most scaffolding nups are organized in two multimeric subcomplexes, the Nup84 or Y complex and the Nic96 or inner ring complex. Working in S. cerevisiae , and to study the assembly of these two essential subcomplexes, we developed a set of twelve nanobodies that recognize seven constituent nucleoporins of the Y and Nic96 complexes. These nanobodies all bind specifically and with high affinity. We present structures of several nup-nanobody complexes, revealing their binding sites. Additionally, constitutive expression of the nanobody suite in S. cerevisiae revealed accessible and obstructed surfaces of the Y complex and Nic96 within the NPC. Overall, this suite of nanobodies provides a unique and versatile toolkit for the study of the NPC.

Receptor signaling shapes cellular functions and specificity in the signaling output is central for delineating biological processes. In legume root cells, very similar and structurally conserved chitin and Nod factor receptor kinases activate immunity, or symbiosis, respectively after perception of chitinous ligands. Here we show that individual residues in the intracellular part of the Nod factor receptor NFR1 determine signal specificity and efficiency distinguishing immunity and symbiotic signaling. Functional investigation of CERK6, NFR1 and receptor variants hereof revealed a conserved motif that we term Symbiosis Determinant 1 in the juxtamembrane region of the kinase domain that is key for symbiotic signaling. We demonstrate that two residues in Symbiosis Determinant 1 are indispensable hallmarks for NFR1 receptors and are sufficient to convert Lotus CERK6 and barley RLK4 functioning in immunity, to initiate symbiotic signaling.

Harnessing the body's intrinsic resources for wound healing is becoming a rapidly advancing field in regenerative medicine research. This study investigates the effects of the topical application of a novel porcine Hypoxia Preconditioned Serum Hydrogel (HPS-H) on wound healing using a minipig model over a 21-day period. Porcine HPS exhibited up to 2.8× elevated levels of key angiogenic growth factors (VEGF-A, PDGF-BB, and bFGF) and demonstrated a superior angiogenic effect in a tube formation assay with human umbilical endothelial cells (HUVECs) in comparison to porcine normal serum (NS). Incorporating HPS into a hydrogel carrier matrix (HPS-H) facilitated the sustained release of growth factors for up to 5 days. In the in vivo experiment, wounds treated with HPS-H were compared to those treated with normal serum hydrogel (NS-H), hydrogel only (H), and no treatment (NT). At day 10 post-wounding, the HPS-H group was observed to promote up to 1.7× faster wound closure as a result of accelerated epithelialization and wound contraction. Hyperspectral imaging revealed up to 12.9% higher superficial tissue oxygenation and deep perfusion in HPS-H-treated wounds at day 10. The immunohistochemical staining of wound biopsies detected increased formation of blood vessels (CD31), lymphatic vessels (LYVE-1), and myofibroblasts (alpha-SMA) in the HPS-H group. These findings suggest that the topical application of HPS-H can significantly accelerate dermal wound healing in an autologous porcine model.

Copper is an essential micronutrient and yet is highly toxic to cells at elevated concentrations. P 1B ‐ATPase proteins are critical for this regulation, providing active extrusion across cellular membranes. One unique molecular adaptation of P 1B ‐ATPases compared to other P‐type ATPases is the presence of metal‐binding domains (MBDs) at the cytosolic termini, which however are poorly characterized with an elusive mechanistic role. Here we present the MBD architecture in metal‐free and metal‐bound forms of the archetype Cu + ‐specific P 1B ‐ATPase LpCopA, determined using NMR. The MBD is composed of a flexible tail and a structured core with a metal ion binding site defined by three sulfur atoms, one of which is pertinent to the so‐called CXXC motif. Furthermore, we demonstrate that the MBD rather than being involved in ion delivery likely serves a regulatory role, which is dependent on the classical P‐type ATPase E1‐E2 transport mechanism. Specifically, the flexible tail appears responsible for autoinhibition while the metal‐binding core is used for copper sensing. This model is validated by a conformation‐sensitive and MBD‐targeting nanobody that can structurally and functionally replace the flexible tail. We propose that autoinhibition of Cu + ‐ATPases occurs at low copper conditions via MBD‐mediated interference with the soluble domains of the ATPase core and that metal transport is enabled when copper levels rise, through metal‐induced dissociation of the MBD. This allows P 1B ‐ATPase ‘vacuum cleaners’ to tune their own activity, balancing the levels of critical micronutrients in the cells.

The CRISPR/Cas9 system has shown great potential for precisely editing genomic DNA sequences by introducing site-specific DNA cuts that are subsequently repaired by the cell. However, delivery of the CRISPR ribonucleoprotein remains an understudied area and hinders realizing the full potential of the system. We prepared Cas9 ribonucleoprotein complexes chemically conjugated to the 7D12 nanobody and demonstrate receptor-mediated transfection of Cas9 into A549 non-small-cell lung cancer cells via binding to the epithelial growth factor receptor for subsequent cell internalization. We further show that transfection with a Cas9 ribonucleoprotein targeting the BRCA2 gene results in an enhanced sensitivity to the chemotherapeutic drug Cisplatin, and thereby induces a synthetic dose lethality in A549 cells.