Mammary stem/progenitor cells (MaSCs) maintain self-renewal of the mammary epithelium during puberty and pregnancy. DNA methylation provides a potential epigenetic mechanism for maintaining cellular memory during self-renewal. Although DNA methyltransferases (DNMTs) are dispensable for embryonic stem cell maintenance, their role in maintaining MaSCs and cancer stem cells (CSCs) in constantly replenishing mammary epithelium is unclear. Here we show that DNMT1 is indispensable for MaSC maintenance. Furthermore, we find that DNMT1 expression is elevated in mammary tumours, and mammary gland-specific DNMT1 deletion protects mice from mammary tumorigenesis by limiting the CSC pool. Through genome-scale methylation studies, we identify ISL1 as a direct DNMT1 target, hypermethylated and downregulated in mammary tumours and CSCs. DNMT inhibition or ISL1 expression in breast cancer cells limits CSC population. Altogether, our studies uncover an essential role for DNMT1 in MaSC and CSC maintenance and identify DNMT1-ISL1 axis as a potential therapeutic target for breast cancer treatment.

Pluripotency is highly dynamic and progresses through a continuum of pluripotent stem-cell states. The two states that bookend the pluripotency continuum, naive and primed, are well characterized, but our understanding of the intermediate states and transitions between them remain incomplete. Here, we dissect the dynamics of pluripotent state transitions underlying pre- to post-implantation epiblast differentiation. Through integrative analysis of the proteome, phosphoproteome, transcriptome, and epigenome of embryonic stem cells transitioning from naive to primed pluripotency, we show that rapid, acute, and widespread changes to the phosphoproteome precede ordered changes to the epigenome, transcriptome, and proteome. Reconstruction of kinase-substrate networks reveals signaling cascades, dynamics, and crosstalk. Distinct waves of global proteomic changes mark discrete phases of pluripotency, characterized by cell surface markers that track pluripotent state transitions. Our data provide new insights into the multi-layered control of the phased progression of pluripotency and a foundation for modeling mechanisms regulating pluripotent state transitions.

Background: Atherosclerotic plaques, especially high-risk ones, form in blood vessel regions exposed to d-flow. EC dysfunction induced by d-flow likely contributes to plaque development. In contrast, regions with laminar flow (l-flow) are less susceptible to plaque formation. Although the Hippo pathway is implicated in mechano-transduction, the exact role and molecular mechanisms of LATS1/2 in response to d-flow remain incompletely understood. Methods: We employed endothelial cell (EC)-specific Lats1 and Lats2 knockout mice within a partial left carotid ligation (PLCL) model to simulate disturbed flow conditions. We characterized plaques using imaging mass cytometry (IMC) and sequential immunofluorescence via COMET TM . Results: We investigated the effects of d-flow on YAP activity and LATS1/2 expression. While both l-flow and d-flow activate YAP activity, only d-flow leads to decreased LATS1/2 expression. We induced Lats1/2 deletion in tamoxifen-inducible Lats1 -/- /Lats2 -/- EKO mice. Within 14 days, all mice (27/27) died due to severe systemic edema and increased vascular permeability. In Lats1 +/- /Lats2 -/- EKO mice (LATS1/2-EKO), we observed atherothrombotic lesions characterized by increased EC proliferation and a senescence-associated secretory phenotype (SASP) in vivo . Mechanistically, d-flow reduces LATS1/2 expression, leading to increased CD38 expression. CD38 triggers not only SASP, but also senescence-associated stemness (SAS) via NAD + depletion, dependent on Lamin A but independent of YAP. We also explored the relationship between CD38 and Ki67 in plaques in vivo. We calculated the logarithm of the Ki67:CD38 expression ratio at the single-cell level using IMC/COMET data. Based on the trimodal density distribution of this parameter, we found that in one group, CD38 and Ki67 were linearly co-expressed, and the percentage of LATS1/2-depleted cells in this group exceeded that of wild type (WT) cells, suggesting that CD38’s pro-proliferative effects dominate under LATS1/2 depletion conditions, despite its role in inducing senescence. Lastly, inhibiting CD38 mitigated d EC SAS/SASP, and atherothrombosis under LATS1/2 depletion conditions. Conclusions: Reduced LATS1/2-mediated CD38 expression in response to d-flow leads to an EC response marked by increased SASP/SAS, ultimately contributing to atherothrombosis. While this phenomenon is common in human advanced coronary atherosclerosis, it is not observed in commonly used mouse models of atherosclerosis.

Background: D-flow’s impact on metabolic reprogramming, particularly glycolysis, needs reevaluation due to its conflicting role in atherosclerosis. We show that d-flow reduces LATS1/2 expression, leading to both EC proliferation and senescence. However, the exact molecular mechanisms remain elusive. Methods: We utilized EC-specific Lats1 +/- /Lats2 -/- knockout (LATS1/2-EKO) mice in a partial left carotid ligation (PLCL) model under hypercholesterolemia with AAV-PCSK9 injection to mimic d-flow. Anti-CD38 antibody (Ab68) and IgG2a control were administered intraperitoneally every 5 days at a dose of 5 mg/kg starting one day before PLCL. Plaque characterization was performed using imaging mass cytometry and sequential immunofluorescence (COMET TM ), integrating spatial metabolite data from Bruker timsTOF Flex Mass Spectrometer, and spatial single-cell metabolite data via the Visiopharm platform. Results: EC LATS1/2 depletion induced a unique atherothrombosis lesion with induced EC proliferation and senescence-associated secretory phenotype (SASP). Utilizing spatial single-cell metabolomics, we cataloged 134 distinct metabolites within the ECs. Subsequent overrepresentation analysis revealed that pathways related to glutamate and the citric acid cycle were enhanced in LATS1/2-EKO mice. Specifically, CD38-dependent downregulation of the pyruvate dehydrogenase (PDH) substrate lipoamide decreased PDH enzymatic activity, linking to CD38 to senescence induction. This inhibition led to a metabolic shift towards YAP-dependent glutaminolysis, and upregulated the citric acid cycle. The use of a glutaminase 1 inhibitor (CB-839) significantly curtailed senescence-associated stemness (SAS), underscoring the pivotal role of CD38 in driving glutaminolysis that contributes to d-flow-induced SAS. Moreover, the application of Ab68 but not IgG2a control decreased atherothrombosis formation following PLCL in LATS1/2-EKO mice. However, the effectiveness of Ab68 in attenuating atherosclerosis in wild-type mice was less pronounced. Conclusions: In the presence of d-flow, upregulated CD38, resulting from reduced LATS1/2 expression, triggers EC responses characterized by increased glutaminolysis and the emergence of an EC SAS phenotype. These processes play a crucial role in a unique form of atherothrombosis. Additionally, CD38’s impact on reducing PDH activity, along with YAP and CD38-mediated enhancement of glutaminolysis, constitutes critical pathways for inducing EC SAS by d-flow.