In rheumatoid arthritis, inflammatory mediators extravasate from blood into joints via gaps between endothelial cells (ECs), but the contribution of ECs is not known. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 (S1PR1), widely expressed on ECs, maintains the vascular barrier. Here, we assessed the contribution of vascular integrity and EC S1PR1 signaling to joint damage in mice exposed to serum-induced arthritis (SIA). EC-specific deletion of S1PR1 or pharmacological blockade of S1PR1 promoted vascular leak and amplified SIA, whereas overexpression of EC S1PR1 or treatment with an S1PR1 agonist delayed SIA. Blockade of EC S1PR1 induced membrane metalloproteinase-dependent cleavage of vascular endothelial cadherin (VE-cadherin), a principal adhesion molecule that maintains EC junctional integrity. We identified a disintegrin and a metalloproteinase domain 10 (ADAM10) as the principal VE-cadherin "sheddase." Mice expressing a stabilized VE-cadherin construct had decreased extravascular VE-cadherin and vascular leakage in response to S1PR1 blockade, and they were protected from SIA. Importantly, patients with active rheumatoid arthritis had decreased circulating S1P and microvascular expression of S1PR1, suggesting a dysregulated S1P/S1PR1 axis favoring vascular permeability and vulnerability. We present a model in which EC S1PR1 signaling maintains homeostatic vascular barrier function by limiting VE-cadherin shedding mediated by ADAM10 and suggest this signaling axis as a therapeutic target in inflammatory arthritis.

Lysophosphatidic acid (LPA) and sphingosine 1-phosphate (S1P) activate G protein-coupled receptors (GPCRs) to regulate key pathobiological processes. Here we report a novel lipid mediator GPCR cross-talk mechanism that modulates lymphatic endothelial junctional architecture in lymph nodes. LPAR1 was identified as an inducer of S1PR1/ β-arrestin coupling from a genome-wide CRISPR/ Cas9 transcriptional activation screen. LPAR1 activation induced S1PR1 β-arrestin recruitment while suppressing Gαi protein signaling. Lymphatic endothelial cells from cortical and medullary sinuses of lymph nodes which express LPAR1 and S1PR1, exhibit porous junctional architecture and constitutive S1PR1 coupling to β-arrestin which was suppressed by the LPAR1 antagonist AM095. In endothelial cells, LPAR1-activation increased trans-endothelial permeability and junctional remodeling from zipper-like structures to puncta of adhesion plaques that terminate at actin-rich stress fibers with abundant intercellular gaps. Cross-talk between LPA and S1P receptors regulates complex junctional architecture of lymphatic sinus endothelial cells, a site of high lymphocyte traffic and lymph flow.

Abstract Serine palmitoyl transferase (SPT), the rate-limiting enzyme in the de novo synthesis of sphingolipids (SL), is needed for embryonic development, physiological homeostasis, and response to stress. The functions of de novo SL synthesis in vascular endothelial cells (EC), which line the entire circulatory system, are not well understood. Here we show that the EC de novo synthesis not only impacts vascular development but also maintains normal SL metabolic homeostasis in the circulatory system and peripheral organs. Mice with an endothelial-specific gene knockout of SPTLC1 ( Sptlc1 ECKO), an essential subunit of the SPT complex, exhibited EC-intrinsic effects including reduced EC proliferation and tip/stalk cell differentiation, resulting in delayed retinal vascular development. In addition, Sptlc1 ECKO mice had reduced pathological retinal neovascularization in the oxygen-induced retinopathy model, suggesting that EC SL produced from the de novo pathway are needed for efficient VEGF signaling within the vascular system. Post-natal deletion of the EC Sptlc1 also showed cell-extrinsic effects, including rapid reduction of several SL metabolites in plasma, red blood cells and peripheral organs (lung and liver) but not in the retina, part of the central nervous system (CNS). In the liver, EC de novo SL synthesis was required for acetaminophen-induced ceramide elevation and hepatotoxicity. These results suggest that EC-derived SL metabolites are in constant flux between the vasculature, circulatory elements, and parenchymal cells of non-CNS organs. Taken together, our data point to the central role of the endothelial SL biosynthesis in maintaining vascular development and neovascular proliferation, non-CNS tissue metabolic homeostasis and hepatocyte response to stress.

Despite the medical importance of G protein-coupled receptors (GPCRs), in vivo cellular heterogeneity of GPCR signaling and downstream transcriptional responses are not understood. We report the comprehensive characterization of transcriptomes (bulk and single-cell) and chromatin domains regulated by sphingosine 1-phosphate receptor-1 (S1PR1) in adult mouse aortic endothelial cells. First, S1PR1 regulates NFκB and nuclear glucocorticoid receptor pathways to suppress inflammation-related mRNAs. Second, spatially distinct S1PR1 signaling in the aorta is associated with heterogenous endothelial cell (EC) subtypes. For example, a transcriptomically distinct arterial EC population at vascular branch points (aEC1) exhibits ligand-independent S1PR1/β-arrestin coupling. In contrast, circulatory S1P-dependent S1PR1/β-arrestin coupling was observed in non-branch point aEC2 cells that exhibit an inflammatory signature. Moreover, an adventitial lymphatic EC (LEC) population shows suppression of lymphangiogenic and inflammation-related transcripts in a S1P/S1PR1-dependent manner. These insights add resolution to existing concepts of GPCR signaling and S1P biology.

Abstract High-density lipoprotein (HDL) particles suppress inflammation-induced tissue injury via vascular and myeloid cell-dependent mechanisms. As such, HDL-associated bioactive lipids such as sphingosine 1-phosphate (S1P) and prostacyclin (PGI 2 ) signal via their respective G protein-coupled receptors on target cells to promote vascular endothelial function and suppress platelet and myeloid-dependent pathophysiology. Here we have constructed a fusion protein of apolipoprotein A1 (ApoA1) and apolipoprotein M (ApoM) (A1M) that forms HDL-like particles and chaperones S1P and Iloprost, stable PGI 2 analog. The A1M/S1P complex activates S1P receptor-1 (S1PR1) as a Gα i -biased agonist and attenuates the inflammation-induced NFκB pathway while A1M/Iloprost acts via IP receptor to inhibit platelet aggregation and promote endothelial barrier function. In addition to enhancing the endothelial barrier, A1M/S1P suppresses neutrophil influx, oxidative burst and inflammatory mediator secretion in a sterile inflammation model. We propose that A1M could be useful as a therapeutic to induce S1P and PGI 2 -dependent anti-inflammatory functions and suppress collateral tissue injury.

Abstract Sphingosine-1-phosphate (S1P), a bioactive lipid mediator that signals via G protein-coupled S1P receptors (S1PR), is required for normal vascular development. The role of this signaling axis in vascular retinopathies is largely unexplored. Here we show in a mouse model of oxygen-induced retinopathy (OIR) that endothelial overexpression of S1pr1 suppresses while endothelial knockout (KO) of S1pr1 worsens neovascular tuft formation. Furthermore, neovascular tufts are increased in Apom KO mice which lack HDL-bound S1P while they are suppressed in Apom TG mice which has more circulating HDL-S1P. These results suggest that circulating HDL-S1P activation of endothelial S1PR1 specifically suppresses proliferative retinal vasculopathy. Moreover, systemic administration of ApoM-Fc-bound S1P or a small molecule Gi-biased S1PR1 agonist suppressed neovascular tuft formation. Circulating HDL-S1P activation of endothelial S1PR1 may be a key protective mechanism to guard against neovascular retinopathies that occur not only in premature infants but also in diabetes and aging.