Angiotensin receptor blockade and neprilysin (NEP) inhibition together offer potential benefits for the treatment of hypertension and heart failure. LCZ696 is a novel single molecule comprising molecular moieties of valsartan and NEP inhibitor prodrug AHU377 (1:1 ratio). Oral administration of LCZ696 caused dose‐dependent increases in atrial natriuretic peptide immunoreactivity (due to NEP inhibition) in Sprague‐Dawley rats and provided sustained, dose‐dependent blood pressure reductions in hypertensive double‐transgenic rats. In healthy participants, a randomized, double‐blind, placebo‐controlled study (n = 80) of single‐dose (200–1200 mg) and multiple‐dose (50–900 mg once daily for 14 days) oral administration of LCZ696 showed that peak plasma concentrations were reached rapidly for valsartan (1.6–4.9 hours), AHU377 (0.5–1.1 hours), and its active moiety, LBQ657 (1.8–3.5 hours). LCZ696 treatment was associated with increases in plasma cGMP, renin concentration and activity, and angiotensin II, providing evidence for NEP inhibition and angiotensin receptor blockade. In a randomized, open‐label crossover study in healthy participants (n = 56), oral LCZ696 400 mg and valsartan 320 mg were shown to provide similar exposure to valsartan (geometric mean ratio [90% confidence interval]: AUC 0‐∞ 0.90 [0.82–0.99]). LCZ696 was safe and well tolerated. These data support further clinical development of LCZ696, a novel, orally bioavailable, dual‐acting angiotensin receptor—NEP inhibitor (ARNi) for hypertension and heart failure.

In this report we investigate the molecular mechanisms that contribute to tissue damage following ischemia and ischemia coupled with reperfusion (ischemia/reperfusion) in the rat heart and kidney. We observe the activation of three stress-inducible mitogen-activated protein (MAP) kinases in these tissues: p38 MAP kinase and the 46- and 55-kDa isoforms of Jun N-terminal kinase (JNK46 and JNK55). The heart and kidney show distinct time courses in the activation of p38 MAP kinase during ischemia but no activation of either JNK46 or JNK55. These two tissues also respond differently to ischemia/reperfusion. In the heart we observe activation of JNK55 and p38 MAP kinase, whereas in the kidney all three kinases are active. We also examined the expression pattern of two stress-responsive genes, c-Jun and ATF3. Our results indicate that in the heart both genes are induced by ischemia and ischemia/reperfusion. However, in the kidney c-Jun and ATF3 expression is induced only by ischemia/reperfusion. To correlate these molecular events with tissue damage we examined DNA laddering, a common marker of apoptosis. A significant increase in DNA laddering was evident in both heart and kidney following ischemia/reperfusion and correlated with the pattern of kinase activation, supporting a link between stress kinase activation and apoptotic cell death in these tissues. In this report we investigate the molecular mechanisms that contribute to tissue damage following ischemia and ischemia coupled with reperfusion (ischemia/reperfusion) in the rat heart and kidney. We observe the activation of three stress-inducible mitogen-activated protein (MAP) kinases in these tissues: p38 MAP kinase and the 46- and 55-kDa isoforms of Jun N-terminal kinase (JNK46 and JNK55). The heart and kidney show distinct time courses in the activation of p38 MAP kinase during ischemia but no activation of either JNK46 or JNK55. These two tissues also respond differently to ischemia/reperfusion. In the heart we observe activation of JNK55 and p38 MAP kinase, whereas in the kidney all three kinases are active. We also examined the expression pattern of two stress-responsive genes, c-Jun and ATF3. Our results indicate that in the heart both genes are induced by ischemia and ischemia/reperfusion. However, in the kidney c-Jun and ATF3 expression is induced only by ischemia/reperfusion. To correlate these molecular events with tissue damage we examined DNA laddering, a common marker of apoptosis. A significant increase in DNA laddering was evident in both heart and kidney following ischemia/reperfusion and correlated with the pattern of kinase activation, supporting a link between stress kinase activation and apoptotic cell death in these tissues. Ischemia and ischemia coupled with reperfusion (ischemia/reperfusion) in the heart and kidney result in cell death and scar formation in these tissues, which can ultimately lead to congestive heart failure or renal failure and death. Recent studies in heart tissue, both in vitro and in vivo, suggest that cell death upon reperfusion is largely apoptotic in nature (1Gottlieb R.A. Burleson K.O. Kloner R.A. Babior B.M. Engler R.L. J. Clin. Invest. 1994; 94: 1621-1628Crossref PubMed Scopus (1365) Google Scholar, 2Umansky S.R. Pisarenko O.I. Serebryakova L.I. Studneva I.M. Tskitishvili O.V. Khutzian S.S. Sukhova T.I. Lichtenstein A.V. Ossina N.K. Kiefer M.C. Tomei L.D. Basic & Applied Myology. 1996; 6: 227-235Google Scholar, 3Tanaka M. Ito H. Adachi S. Akimoto H. Nishikawa T. Kasajima T. Marumo F. Hiroe M. Circ. Res. 1993; 75: 426-433Crossref Scopus (570) Google Scholar, 4Umansky S.R. Cuenco G.M. Khutzian S.S. Barr P.J. Tomei L.D. Cell Death & Differ. 1995; 2: 235-241PubMed Google Scholar).In vivo studies demonstrated that apoptosis following occlusion of the coronary artery in the rat is the major contributing factor to myocardial damage after the insult. Subsequently, necrosis occurs and contributes to the progressive loss of cardiomyocytes with time after infarction (5Kajstura J. Cheng W. Reiss K. Clark W.A. Sonnenblick E.H. Krajewski S. Reed J.C. Olivetti G. Anversa P. Lab. Invest. 1996; 74: 86-107PubMed Google Scholar). Apoptotic cell death also appears to play a role in hypertrophy of cardiac tissue in response to pressure overload (6Teiger E. Dam T.-V. Richard L. Wisnewsky C. Tea B.-S. Gaboury L. Tremblay J. Schwartz K. Hamet P. J. Clin. Invest. 1996; 97: 2891-2897Crossref PubMed Scopus (398) Google Scholar, 7Cheng W. Li B. Kajstura J. Li P. Wolin M.S. Sonnenblick E.H. Hintze T.H. Olivetti G. Anversa P. J. Clin. Invest. 1995; 96: 2247-2259Crossref PubMed Scopus (592) Google Scholar). The occurrence of apoptotic cell death in renal tissue has also been demonstrated following brief periods of ischemia and subsequent reperfusion (8Schumer M. Colombel M.C. Sawczuk I.S. Gobe G. Connor J. O'Toole K.M.O. Olsson C.A. Wise G.J. Buttyan R. Am. J. Pathol. 1992; 140: 831-838PubMed Google Scholar). The molecular mechanisms by which ischemia and ischemia/reperfusion lead to cell death and eventually to tissue damage have not yet been defined. Recent studies suggest that members of the mitogen-activated protein (MAP) 1The abbreviations used are: MAP, mitogen-activated protein; JNK, Jun N-terminal kinase; DTT, dithiothreitol. kinase family, in particular Jun N-terminal kinase (JNK), are activated in the heart and kidney following ischemia and reperfusion of these tissues (9Knight R.J. Buxton D.B. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 218: 83-88Crossref PubMed Scopus (153) Google Scholar, 10Pombo C.M. Bonventre J.V. Avruch J. Woodgett J.R. Kyriakis J.M. Force T. J. Biol. Chem. 1994; 269: 26546-26551Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Therefore, this kinase signaling pathway may be an important molecular component responsible for tissue injury following ischemia and ischemia/reperfusion in the heart and kidney. However, the role of individual isoforms of JNK or the role of p38 MAP kinase has not been addressed. The MAP kinase family, members of which are characterized as proline-directed serine/threonine-protein kinases, can be divided into three subgroups: the extracellular signal-regulated kinases, JNKs (also referred to as stress-activated protein kinases), and p38 MAP kinases. These kinase pathways are distinguished by activating signals, substrate specificity, and cellular responses (for review, see Refs.11Davis R.D. Trends Biochem. Sci. 1994; 19: 470-473Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (941) Google Scholar, 12Cano E. Mahadevan L.C. Trends Biochem. Sci. 1996; 20: 117-122Abstract Full Text PDF Scopus (1008) Google Scholar, 13Waskiewicz A.J. Cooper J.A. Curr. Opin. Cell Biol. 1995; 7: 798-805Crossref PubMed Scopus (538) Google Scholar). While the extracellular signal-regulated kinases are predominantly activated by growth factors, the JNKs and p38 MAP kinases are activated by stress signals such as inflammatory cytokines, heat shock, ultraviolet light, and ischemia (9Knight R.J. Buxton D.B. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 218: 83-88Crossref PubMed Scopus (153) Google Scholar, 10Pombo C.M. Bonventre J.V. Avruch J. Woodgett J.R. Kyriakis J.M. Force T. J. Biol. Chem. 1994; 269: 26546-26551Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 14Kyriakis J.M. Banerjee P. Nikolakaki E. Dai T. Rubie E.A. Ahmad M.F. Avruch J. Woodgett J.R. Nature. 1994; 369: 156-160Crossref PubMed Scopus (2481) Google Scholar, 15Raingeaud J. Gupta S. Rodgers J.S. Dickens M. Han J. Ulevitch R.J. Davis R.J. J. Biol. Chem. 1995; 270: 7420-7426Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2061) Google Scholar, 16Bogoyevitch M.A. Ketterman A.J. Sugden P.H. J. Biol. Chem. 1995; 270: 29710-29717Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (206) Google Scholar). Because JNKs and p38 MAP kinases are generally activated by the same stress signals, they have been collectively referred to as the stress kinases. Two members of the JNK family (JNK1 (46 kDa) and JNK2 (55 kDa)) were initially identified as kinases with high affinity for the transcription factor c-Jun. JNKs phosphorylate c-Jun on specific N-terminal serine residues (Ser-63 and Ser-73) and enhance the ability of c-Jun to activate expression of genes containing c-Jun-responsive promoter elements (14Kyriakis J.M. Banerjee P. Nikolakaki E. Dai T. Rubie E.A. Ahmad M.F. Avruch J. Woodgett J.R. Nature. 1994; 369: 156-160Crossref PubMed Scopus (2481) Google Scholar, 17Derijard B. Hibi M. Wu H. Barret T. Su B. Deng T. Karin M. Davis R. Cell. 1994; 76: 1025-1037Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3032) Google Scholar, 18Hibi M. Lin A. Smeal A. Minden A. Karin M. Genes & Dev. 1993; 7: 2135-2148Crossref PubMed Scopus (1723) Google Scholar, 19Kallunki T. Su B. Tsigelny I. Sluss H.K. Derijard B. Moore G. Davis R. Karin M. Genes & Dev. 1994; 8: 2996-3007Crossref PubMed Scopus (604) Google Scholar, 20Sluss H.K. Barrett T. Derijard B. Davis R.J. Mol. Cell. Biol. 1994; 14: 8376-8384Crossref PubMed Scopus (455) Google Scholar). Additional substrates for JNKs have been defined since their first identification; the substrates include ATF2 and Elk-1 (21Cavigelli M. Dolfi F. Claret F.-X. Karin M. EMBO J. 1995; 14: 5957-5964Crossref PubMed Scopus (491) Google Scholar, 22Gupta S. Campbell D. Derijard B. Davis R.J. Science. 1995; 267: 389-393Crossref PubMed Scopus (1353) Google Scholar). Recently, at least 10 isoforms of JNK have been identified, which correspond to alternatively spliced variants derived from three genes. These JNK isoforms differ in their interaction with substrate proteins in vitro, suggesting that these isoforms may play specific roles in vivo (23Gupta S. Barrett T. Whitmarsh A.J. Cavanagh J. Sluss H.K. Derijard B. Davis R.J. EMBO J. 1996; 15: 2760-2770Crossref PubMed Scopus (1196) Google Scholar). However, specific activation of individual isoforms in vivohas not been demonstrated to date. Multiple isoforms of p38 MAP kinase have also been identified (24Lee J.C. Laydon J.T. McDonnell P.C. Gallagher T.F. Kumar S. Green D. McNulty D. Blumenthal M.J. Heys J.R. Landvatter S.W. Strickler J.E. Mclaughlin M.M. Siemens I.R. Fisher S.M. Livi G.P. White J.R. Adams J.L. Young P.R. Nature. 1994; 372: 739-746Crossref PubMed Scopus (3186) Google Scholar, 25Mertens S. Craxton M. Goedert M. FEBS Lett. 1996; 383: 273-276Crossref PubMed Scopus (137) Google Scholar, 26Zervos A.S. Faccio L. Gatto J.P. Kyriakis J.M. Brent R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 10531-10534Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar, 27Jiang Y. Chen C. Li Z. Guo W. Gegner J.A. Lin S. Han J. J. Biol. Chem. 1996; 271: 17920-17926Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (665) Google Scholar). Although p38 MAP kinases and JNKs are activated by similar stress signals, the kinase cascade leading to the activation of p38 MAP kinases is distinct from the kinase cascade leading to the activation of JNKs (for review, see Ref. 28Woodgett J.R. Kyriakis J.M. Avruch J. Zon L.I. Philos. Trans. R. Soc. Lond-Biol. Sci. 1996; 351: 135-142Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar). Furthermore, the substrate specificity of p38 MAP kinase, although not well defined, is distinct from that of JNKs: p38 MAP kinase phosphorylates mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase-2 and -3 and CHOP, which are not substrates for JNKs (29Rouse J. Cohen P. Trigon S. Morange M. Alonso-Llamazares A. Zamanillo D. Hunt T. Nebreda A.R. Cell. 1994; 78: 1027-1037Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1540) Google Scholar, 30McLaughlin M.M. Kumar S. McDonnell P.C. Van Horn S. Lee J.C. Livi G.P. Young P.R. J. Biol. Chem. 1996; 271: 8488-8492Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (308) Google Scholar, 31Wang X. Ron D. Science. 1996; 272: 1347-1349Crossref PubMed Scopus (753) Google Scholar). A number of recent studies have indicated an important role for the stress kinases (JNKs and p38 MAP kinase) in stress-induced apoptosis (32Chen Y.-R. Meyer C.F. Tan T.-H. J. Biol. Chem. 1996; 271: 631-634Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (462) Google Scholar, 33Verheij M. Bose R. Lin X.H. Yao B. Jarvis W.D. Grant S. Birrer M.J. Szabo E. Zon L.I. Kyriakis J.M. Haimovitz-Friedman A. Fuks Z. Kolesnick R.N. Nature. 1996; 380: 75-79Crossref PubMed Scopus (1724) Google Scholar, 34Xia Z. Dickens M. Raingeaud J. Davis R.J. Greenberg M.E. Science. 1995; 270: 1326-1331Crossref PubMed Scopus (5074) Google Scholar, 35Zanke B.W. Boudreau K. Rubie E. Winnett E. Tibbles L.A. Zon L. Kyriakis J. Liu F.-F. Woodgett J.R. Curr. Biol. 1996; 6: 606-613Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (440) Google Scholar). Furthermore, one of the major JNK substrates, c-Jun, has been implicated to be important in neuronal apoptosis (36Estus S. Zaks W.J. Freeman R.S. Gruda M. Bravo R. Johnson E.M. J. Cell Biol. 1994; 127: 1717-1727Crossref PubMed Scopus (793) Google Scholar,37Ham J. Babji C. Whitfield J. Pfarr C.M. Lallemand D. Yaniv M. Rubin L.L. Neuron. 1995; 14: 927-939Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (760) Google Scholar). In light of these observations, we examined the patterns of stress kinase activation in ischemic and ischemic/reperfused heart and kidney. Our results demonstrate specific patterns of stress kinase activation in these injured tissues. Furthermore, we observe a strong correlation between stress kinase activation, increased expression of stress kinase responsive genes, and initiation of apoptotic cell death. These results provide insight into the molecular events leading to tissue injury following ischemia/reperfusion. Their implications with respect to the tissue-specific patterns of injury progression are discussed. Antibodies specific for phosphorylated p38 MAP kinase (catalog number 9211S) were purchased from New England Biolabs and used at 1 μg/ml for Western blot analysis. Anti-p38 MAP kinase C-terminal antibodies (catalog number sc-535) and anti-JNK antibodies (catalog number sc-571) were purchased from Santa Cruz Biotechnology Inc., and 0.5 μg/ml was used for Western blot analysis. The ECL kit for Western blot analysis was obtained from Amersham Life Science. GST·c-Jun (amino acids 1–223) protein was produced inEscherichia coli and purified using glutathione-Sepharose-4B (Pharmacia Biotech Inc.). Adult male Sprague-Dawley rats were injected with heparin (5000 IU/kg, body weight intraperitoneally) and then were anesthetized with pentobarbital sodium (75 mg/kg, body weight, intraperitoneally). The hearts were excised and were placed in ice-cold Krebs-Henseleit buffer (containing 118 mm NaCl, 4.7 mm KCl, 2.5 mm CaCl2, 1.2 mm MgSO4, 1.2 mm KH2PO4, 25 mmNaHCO3, 0.5 mm EDTA, and 5 mmglucose). Each heart was immediately cannulated at the aorta, and perfusion was initiated with oxygenated (95% O2, 5% CO2) Krebs-Henseleit buffer (37 °C) at a constant pressure of 75 mm Hg. Hearts were perfused for 30 min with Krebs-Henseleit buffer for equilibration. At this point hearts were subjected to global ischemia for 20 or 45 min and then were reperfused for a designated period of time. At the end of the experiment, the hearts were freeze-clamped, and the frozen tissue was pulverized and was stored at −70 °C. Purpose-bred mongrel dogs (Barton's West End Farms, Oxford, NJ) were anesthetized (pentobarbital sodium, 30 mg/kg intravenously), intubated, and ventilated with room air. Arterial blood gases and pH were maintained within normal limits by intravenous infusion of bicarbonate and adjustment of the ventilation rate. Rectal temperature was maintained within ±0.5 °C of base-line temperature. Cannulas were inserted into a femoral artery and vein for obtaining arterial blood samples and administering bicarbonate and supplemental doses of pentobarbital, respectively. Arterial pressure was measured with a pressure transducer cannula (Millar Instruments, Inc., Houston, TX) inserted into the aortic arch via the contralateral femoral artery. The thorax was opened at the left fifth intercostal space, and a pericardial cradle was created. Left ventricular pressure and its first derivative (dP/dt) were measured with a Millar catheter inserted into the left ventricular chamber through an apical stab wound. Hemodynamic signals were monitored continuously with a strip chart recorder and a digital data acquisition system (Modular Instruments, Inc., Malvern, PA). A short segment of the left anterior descending coronary artery was isolated distal to its first major branch. After allowing hemodynamic stabilization for at least 30 min, the experimental protocol was initiated. Regional myocardial ischemia was achieved by occlusion of the left anterior descending coronary artery for 60 min followed by reperfusion for an additional 60 min. The presence of an ischemic insult was verified by a discernible darkening of the myocardial surface circumscribed by the epicardial coronary vasculature distal to the occlusion site. Transmural myocardial biopsy samples (∼10–20 mg) were obtained serially from the core of the ischemic region with a 14-gauge biopsy needle (Tru-Cut, Baxter, Deerfield, IL) at base line (i.e.preischemia), at the end of the ischemic period, and at 2, 5, 10, 11, 22, 26, 30, and 60 min of reperfusion. All samples were obtained from distal to proximal in the perfusion bed to minimize potential confounding effects of localized disruption of blood flow to regions distal to the sampling sites. Additional control tissue specimens were acquired from the nonischemic cardiac region perfused by the left circumflex coronary artery at base line, at the end of ischemia, and at various times during the reperfusion period. Myocardial tissue samples were removed from the needle, rinsed with saline, and quickly (within ∼10 s) frozen in liquid nitrogen. Frozen samples were stored at −70 °C until the time of assay. All experiments were performed in male Sprague-Dawley rats weighing between 300 and 500 g. Following induction of anesthesia (Inactin, 100 mg/kg intraperitoneally), the left kidney was exposed via a flank incision, and left renal artery occlusion was performed using an atraumatic vascular clamp. Reperfusion was achieved by removing the clamp. The effect of varying the duration of reperfusion was assessed by occluding the renal artery for 60 min and then reperfusing the kidney for indicated periods. The right kidney served as a nonischemic control. Rats were sacrificed upon completion of either ischemia or ischemia/reperfusion, and kidneys were immediately removed and were rapidly frozen in liquid nitrogen. All renal tissues were then kept at −70 °C until further assay. A powder of frozen heart and kidney tissues was prepared using a mortar and pestle. For homogenization, 100 mg of tissue powder was weighed out and was homogenized in 1 ml of buffer (20 mm Hepes (pH 7.5), 20 mmβ-glycerophosphate, 20 mm sodium pyrophosphate, 0.2 mm sodium vanadate, 2 mm EDTA, 20 mm sodium fluoride, 10 mm benzamidine, 1 mm DTT, 20 μg/ml leupeptin, and 0.2 mmpefabloc SC) using a Dounce homogenizer. Cell debris was removed by centrifugation (20,000 × g for 10 min at 4 °C), and the supernatant was stored in aliquots at −70 °C. In gel kinase assays were performed as described previously (38Cano E. Hazzalin C.A. Mahadevan L.C. Mol. Cell. Biol. 1994; 14: 7352-7362Crossref PubMed Scopus (275) Google Scholar) with some modifications. Proteins (80 μg/sample) extracted from heart and kidney tissues were separated on a 10% SDS-polyacrylamide gel that had been polymerized in the presence of 50 μg/ml GST·c-Jun (amino acids 1–223). After electrophoresis, the gel was washed five times for 10 min with 60 ml of buffer A (20% isopropyl alcohol in 50 mm Tris-HCl (pH 8.0)) to remove SDS. Next, the gel was washed five times for 10 min with 60 ml of buffer B (1 mm DTT, 50 mm Tris-HCl (pH 8.0)). To denature proteins, the gel was incubated with 60 ml of buffer C (6m guanidine HCl, 20 mm DTT, 2 mmEDTA, 50 mm Tris-HCl (pH 8.0)) for 1 h at room temperature with shaking. Finally, the gel was incubated in 300 ml of buffer D (1 mm DTT, 2 mm EDTA, 0.05% Tween 20, 50 mm Tris-HCl (pH 8.0)) for 16 h at 4 °C to renature proteins. For the kinase assay, the gel was first equilibrated with kinase buffer (20 mm HEPES (pH 7.6), 20 mmMgCl2, 20 mm β-glycerol phosphate, 20 mm p-nitrophenylphosphate, 2 mm DTT, 0.2 mm sodium vanadate) for 1 h at room temperature with shaking. The kinase assay was initiated by adding 10 ml of kinase buffer containing 20 mm ATP and 10 μCi/ml of [γ-32P]ATP, and the gel was incubated at 30 °C for 60 min with shaking. The gel was washed several times with 5% trichloroacetic acid and 1% sodium pyrophosphate to remove free radioactivity, followed by drying and autoradiography. The procedures for immunoprecipitation and immunoblotting were described previously (39Yin T. Keller S.R. Quelle F.W. Witthuhn B.A. Tsang M.L.-S. Lienhard G.E. Ihle J.N. Yang Y.-C. J. Biol. Chem. 1995; 270: 20497-20502Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (92) Google Scholar). In short, proteins (500 μg/sample) extracted from heart and kidney tissues were incubated with 2 μg of anti-p38 MAP kinase C-terminal antibodies at 4 °C for 2 h with rotation. Protein A-agarose beads (20 μl/sample) were then added to each sample and incubated for an additional 40 min at 4 °C with rotation. The immune complexes precipitated with protein A-agarose were washed four times with buffer containing 50 mm Tris-HCl (pH 8.0), 1 mm sodium vanadate, 0.2 mm pefabloc SC, 20 μg/ml leupeptin, 150 mm NaCl, 20 mm sodium fluoride, and 0.1% Triton X-100. The immunoprecipitates were immobilized on polyvinylidene difluoride membrane after separation on 10% SDS-PAGE. The membrane was immunoblotted with anti-phospho-p38 MAP kinase antibodies using the ECL method to evaluate tyrosine phosphorylation of p38 MAP kinase. The same membrane was then reblotted with anti-p38 MAP kinase antibodies after stripping to verify that equivalent amounts of p38 MAP kinase protein were loaded in each lane. Ischemic and ischemic/reperfused hearts were obtained from rats as described previously (40Chen B.P.C. Wolfgang C.D. Hai T. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 1157-1168Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar). Ischemic and ischemic/reperfused kidneys were obtained as described above. The tissues were frozen in isopentane prechilled with liquid nitrogen and kept at −70 °C until further assay. In situhybridization was carried out using ATF3 or c-Jun antisense RNA probes as described previously (40Chen B.P.C. Wolfgang C.D. Hai T. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 1157-1168Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar). Total RNA was isolated using a guanidium isothiocyanate and organic extraction method as outlined by the manufacturer (5 Prime → 3 Prime, Inc., Boulder, CO). 5 μg of total RNA was loaded onto a 1% formaldehyde-agarose gel, transferred to Hybond membrane (Amersham), UV-cross-linked, hybridized to 32P-labeled rat c-Jun or rat ATF3 partial cDNAs using QuikHyb (Stratagene), and washed at high stringency as outlined by the manufacturer. The pulverized tissues from rat heart and kidney were lysed with lysis buffer (50 mm Tris-HCl (pH 8.0), 10 mm EDTA, 0.5% SDS, and 100 mm NaCl) and digested in lysis buffer containing 1 mg/ml of protease K at 55 °C for 16 h. DNA was then extracted with Isoquik rapid DNA isolation kit (ORCA Research Inc., Bothell, WA) according to the manufacturer's instructions, and the concentration was determined based on absorbance at 260 nm. For visualization of DNA laddering, DNA (1 μg/sample) was labeled at room temperature for 10–15 min using 5 units of Klenow fragment (NEB 212) in a total volume of 10 μl containing 0.5 μCi of [α-32P]dATP. The labeled DNA was then subjected to electrophoresis on a 1 or 1.8% agarose gel. The gels were fixed with 10% acetic acid for 2 h at room temperature followed by drying, or the DNA was transferred to nylon membranes and UV-cross-linked followed by baking at 80 °C for 1 h. The dried gels and membranes were then autoradiographed for periods ranging from 2 h to overnight as indicated in Fig. 8.Figure 1Activation of JNK in ischemic and ischemic/reperfused rat and dog heart. A, in gel kinase assay of extracts from control rat hearts or rat hearts subjected to ischemia (45 min) or ischemia/reperfusion for the indicated times. Aliquots of extracts containing 80 μg of protein were loaded on a 10% SDS-polyacrylamide gel polymerized in the presence of GST·c-Jun (amino acids 1–223). B, Western blot analysis of the protein levels of JNK isoforms. Aliquots of samples as described inA were resolved on a regular 10% SDS-polyacrylamide gel and analyzed by immunoblot using anti-JNK antibodies (0.5 μg/ml) that react with both JNK46 and JNK55 to estimate the protein levels of the isoforms. C, in gel kinase assay of extracts from control dog hearts or dog hearts subjected to ischemia (60 min) or ischemia/reperfusion for the indicated times.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Figure 8Electrophoretic pattern of DNA laddering following ischemia and ischemia/reperfusion in the rat heart and kidney. DNAs from control, ischemic, and ischemic/reperfused heart (A) and kidney (B) were isolated, and 1 μg of DNA/sample was labeled with radioisotope as described under “Experimental Procedures.” A, the labeled DNAs were analyzed on 1% agarose gel transferred to a nylon membrane, UV-cross-linked, and autoradiographed overnight. B, the labeled DNAs were resolved on a 1.8% agarose gel, fixed with acetic acid, dried, and autoradiographed for 2 h.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) Isolated rat hearts were subject to global ischemia for either 20 or 45 min prior to reperfusion. Individual hearts were reperfused for various periods ranging from 1 min to 3 h. Extracts from the hearts were then prepared, and stress kinase activity was measured by either in gel kinase assay using c-Jun (amino acids 1–223) as a substrate, or Western blotting using phospho-specific antibodies. Neither JNK46 nor JNK55 activity, measured by in gel kinase assay, was detectable in control hearts or in hearts subjected to ischemia for either 20 min (data not shown) or 45 min (Fig. 1 A). However, JNK55 activity was detectable within 1 min following reperfusion; it continued to increase, reaching maximal activity at approximately 1 h postreperfusion. Significant levels of JNK55 activity were still present at 3 h postreperfusion. Interestingly, no significant levels of JNK46 activity were detectable upon reperfusion of the heart until 1 h postreperfusion, when some weak JNK46activity was evident. The lack of significant JNK46activation in the heart was not a consequence of the absence of JNK46 expression, because JNK46 protein was readily detectable by Western analysis using an antibody recognizing both isoforms (Fig. 1 B). Furthermore, the Western analysis confirmed that similar levels of JNK were present in all samples. This result indicates that there is a preferential activation of JNK55 in the isolated heart following reperfusion. The preferential activation of JNK55 was confirmed in vivo by examining JNK activation in dog heart tissue following ischemia/reperfusion (Fig. 1 C). Small biopsies of cardiac tissue were removed from the exposed dog heart in vivo prior to ischemia and at the indicated time points following ischemia and reperfusion. The profile of JNK activation is essentially identical to that observed in the isolated rat heart. However, the peak in JNK55 activity appears to be reached sooner in vivo. Preferential activation of a JNK isoform in tissues has not been reported previously, and these observations may suggest a specific role for a JNK55 in the heart. p38 MAP kinase activity was measured by Western analysis using anti-phospho-p38 antibodies (Fig.2 A). In a parallel experiment, p38 MAP kinase protein levels were measured by Western analysis using an anti-p38 antibody to ensure that similar levels of p38 MAP kinase protein were present in all samples (Fig. 2 B). No detectable p38 MAP kinase activity was present in control hearts. However, consistent with the recent report by Bogoyevitch et al.(41Bogoyevitch M.A. Gillespie-Brown J. Ketterman A.J. Fuller S.J. Ben-Levy R. Ashworth A. Marshall C.J. Sugden P.H. Circ. Res. 1996; 79: 162-173Crossref PubMed Scopus (494) Google Scholar), p38 MAP kinase was activated in the heart subjected to 20 min of ischemia (Fig. 2 B, right part). This activation was transient, because p38 MAP kinase activity was not detectable after 45 min of ischemia (Fig. 2 A, left part). Significantly, upon reperfusion following 45 min of ischemia, p38 MAP kinase was rapidly reactivated: the kinase activity was detectable within 1 min postreperfusion, reached a maximal level at approximately 15 min, and returned to a low level within 3 h. We conclude that in the ischemic heart, p38 MAP kinase is transiently activated. Independent of the time of ischemia, p38 MAP kinase is active upon reperfusion. Rat kidneys, in vivo, were made ischemic by ligation of the renal artery for 1 h. Kidneys were reperfused for various periods ranging from 5 min to 3 h. Extracts were then prepared from the treated kidney or control (i.e. contralateral) kidney. JNK activity was measured by in gel kinase analysis. As observed in the heart, no JNK activity was detectable in the control kidneys or in the ischemic kidney. Upon reperfusion, however, both JNK46 and JNK55 were activated within 10 min, unlike in the heart where JNK55 was preferentially activated. The activities of both kinases were high for approximately 90 min and returned to near basal level by 2 h (Fig.3 A). Therefore, the pattern of JN

Simultaneous blockade of angiotensin receptors and enhancement of natriuretic peptides (NP) by the first-in-class angiotensin receptor neprilysin (NEP) inhibitor sacubitril/valsartan constitutes an effective approach to treating heart failure. This study examined the effects of sacubitril/valsartan (225 and 675mg/day) vs. placebo, sacubitril (360mg/day), valsartan (900mg/day), and benazepril (5mg/day) on the dynamics of the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) and the NP system in dogs. Beagle dogs (n=18) were fed a low-salt diet (0.05% Na) for 15 days to model RAAS activation observed in clinical heart failure. Drugs were administered once daily during the last 10 days, while the effects on the RAAS and NPs were assessed on days 1, 5, and 10. Steady-state pharmacokinetics of the test agents were evaluated on day 5. Compared with placebo, sacubitril/valsartan (675mg) substantially increased cGMP circulating levels, while benazepril and valsartan showed no effect. Additionally, sacubitril/valsartan (675mg) and valsartan significantly increased plasma renin activity, angiotensin I and angiotensin II concentrations. Finally, sacubitril/valsartan (both doses), and valsartan significantly decreased plasma aldosterone vs. placebo. Systemic exposure to valsartan following sacubitril/valsartan 675mg administration was similar to that observed with valsartan 900mg administration alone. Sacubitril/valsartan favorably modulates the dynamics of the renin and NP cascades through complementary NEP and RAAS inhibition.