Hedgehog (Hh) signaling, an evolutionarily conserved pathway, plays an essential role in development and tumorigenesis, making it a promising drug target. Multiple negative regulators are known to govern Hh signaling; however, how activated Smoothened (SMO) participates in the activation of downstream GLI2 and GLI3 remains unclear. Herein, we identified the ciliary kinase DYRK2 as a positive regulator of the GLI2 and GLI3 transcription factors for Hh signaling. Transcriptome and interactome analyses demonstrated that DYRK2 phosphorylates GLI2 and GLI3 on evolutionarily conserved serine residues at the ciliary base, in response to activation of the Hh pathway. This phosphorylation induces the dissociation of GLI2/GLI3 from suppressor, SUFU, and their translocation into the nucleus. Loss of

Neuronatin (Nnat) is expressed in the pituitary, pancreas, and other tissues; however, the function of NNAT is still unclear. Recent studies have demonstrated that NNAT is localized in the sex determining region Y-box 2-positive stem/progenitor cells in the developing rat pituitary primordium and is downregulated during differentiation into mature hormone-producing cells. Moreover, NNAT is widely localized in subcellular organelles, excluding the Golgi. Here, we further evaluated NNAT expression and intracellular localization in embryonic and postnatal rat tissues such as the pancreas, tongue, whisker hair follicle, and testis. Immunohistochemistry showed that NNAT was localized in undifferentiated cells (i.e., epithelial basal cells and basement cells in the papillae of the tongue and round and elongated spermatids of the testis) as well as in differentiated cells (insulin-positive cells and exocrine cells of the pancreas, taste receptor cells of the fungiform papilla, the inner root sheath of whisker hair follicles, and spermatozoa). Additionally, NNAT showed novel intracellular localization in acrosomes in the spermatozoa. Because the endoplasmic reticulum (ER) is excluded from spermatozoa and sarco/ER Ca2+-ATPase isoform 2 (SERCA2) is absent from the inner root sheath, these findings suggested that NNAT localization in the ER and its interaction with SERCA2 were cell- or tissue-specific properties.

Abstract The functional maturation of the pituitary gland requires adequate cell differentiation and vascular network formation. Although spatiotemporal signaling and transcription factors are known to govern pituitary development, the involvement of primary cilia, non-moving hair-like organelles, remains unclear. In this study, we uncovered the contribution of primary cilia to cell-type determination and vascular network formation during pituitary development. Homozygous knockout mice lacking a ciliary kinase, Dyrk2−/−, exhibit abnormalities in ciliary structure and pituitary hypoplasia, accompanied by varying degrees of failure in differentiation among all types of hormone-producing cells in the anterior lobe. Aberrations in cell differentiation in Dyrk2−/− mice arise from a decrease in the expression of crucial transcription factors, Lhx4, Lhx3, and Prop1, resulting from the inactivity of Hedgehog (Hh) signaling during the early stages of development. Furthermore, the loss of Dyrk2 results in vascular system abnormalities during the middle to late stages of development. Mechanistically, transcriptome analyses revealed the down-regulation of vitronectin-integrin αvβ3-VEGFR2 signaling, essential for orchestrating vascular development. Collectively, our findings demonstrate that primary cilia play a pivotal role as critical regulators of cell survival, cell determination, and angiogenesis during pituitary gland development through the activation of Hh signaling. These findings expand our understanding of the potential link between pituitary dysfunction in human disorders and ciliopathies.

The GLI1/GLI2/GLI3 transcription factors mediate Hedgehog (Hh) signaling, which is crucial for bone development. During intramembranous ossification, mesenchymal stem cells (MSCs) are directly differentiated into osteoblasts. Under basal and Hh pathway-stimulated conditions, primary cilia play essential roles in proteolytic processing of GLI3 to its repressor form (GLI3R), and in activation of GLI2. Although previous studies in mice suggested that Gli1 expression depends on GLI2 and GLI3, coordinated roles of GLI1, GLI2, and GLI3 in osteogenic differentiation are not fully understood at the cellular level. From the MSC line C3H10T1/2, we established Gli2-knockout (KO) and Gli3-KO cells, and constitutively GLI3R-producing (cGLI3R) cells, and expressed GLI1, GLI2, and GLI3 constructs in these cells. The results demonstrate at the cellular level that GLI2 and GLI3R counterregulate osteogenic differentiation via activating and repressing Gli1 expression, respectively; GLI3R, which results from GLI3 processing requiring protein kinase A-mediated phosphorylation, downregulates expression of Gli2 as well as Gli1; and GLI1 upregulates Gli1 itself and Gli2, constituting a GLI1–GLI2 positive feedback loop.