DOT1 was originally identified as a gene affecting telomeric silencing in S. cerevisiae. We now find that Dot1p methylates histone H3 on lysine 79, which maps to the top and bottom of the nucleosome core. Methylation occurs only when histone H3 is assembled in chromatin. In vivo, Dot1p is solely responsible for this methylation and methylates ∼90% of histone H3. In dot1Δ cells, silencing is compromised and silencing proteins become redistributed at the expense of normally silenced loci. We suggest that methylation of histone H3 lysine 79 limits silencing to discrete loci by preventing the binding of Sir proteins elsewhere along the genome. Because Dot1p and histone H3 are conserved, similar mechanisms are likely at work in other eukaryotes.

Chromatin states can be distinguished by differential covalent modifications of histones or by utilization of histone variants. Chromatin associated with transcriptionally active loci becomes enriched for histones with particular lysine modifications and accumulates the H3.3 histone variant, the substrate for replication-independent nucleosome assembly. However, studies of modifications at particular loci have not distinguished between histone variants, so the relationship among modifications, histone variants, and nucleosome assembly pathways is unclear. To address this uncertainty, we have quantified the relative abundance of H3 and H3.3 and their lysine modifications. Using a Drosophila cell line system in which H3.3 has been shown to specifically package active loci, we found that H3.3 accounts for ≈25% of total histone 3 in bulk chromatin, enough to package essentially all actively transcribed genes. MS and antibody characterization of separated histone 3 fractions revealed that H3.3 is relatively enriched in modifications associated with transcriptional activity and deficient in dimethyl lysine-9, which is abundant in heterochromatin. To explain enrichment on alternative variants, we propose that histone modifications are tied to the alternative nucleosome assembly pathways that use primarily H3 at replication forks and H3.3 at actively transcribed genes in a replication-independent manner.

Article25 May 2006free access Myc influences global chromatin structure Paul S Knoepfler Paul S Knoepfler Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Xiao-yong Zhang Xiao-yong Zhang The Wistar Institute, Gene Expression and Regulation Program, Philadelphia, PA, USA Search for more papers by this author Pei Feng Cheng Pei Feng Cheng Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Philip R Gafken Philip R Gafken Proteomics Facility, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Steven B McMahon Steven B McMahon The Wistar Institute, Gene Expression and Regulation Program, Philadelphia, PA, USA Search for more papers by this author Robert N Eisenman Corresponding Author Robert N Eisenman Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Paul S Knoepfler Paul S Knoepfler Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Xiao-yong Zhang Xiao-yong Zhang The Wistar Institute, Gene Expression and Regulation Program, Philadelphia, PA, USA Search for more papers by this author Pei Feng Cheng Pei Feng Cheng Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Philip R Gafken Philip R Gafken Proteomics Facility, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Steven B McMahon Steven B McMahon The Wistar Institute, Gene Expression and Regulation Program, Philadelphia, PA, USA Search for more papers by this author Robert N Eisenman Corresponding Author Robert N Eisenman Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA Search for more papers by this author Author Information Paul S Knoepfler1, Xiao-yong Zhang2, Pei Feng Cheng1, Philip R Gafken3, Steven B McMahon2 and Robert N Eisenman 1 1Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA 2The Wistar Institute, Gene Expression and Regulation Program, Philadelphia, PA, USA 3Proteomics Facility, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA *Corresponding author. Division of Basic Sciences, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 1100 Fairview Avenue N, Seattle, WA 98109-4417, USA. Tel.: +1 206 667 4445; Fax: +1 206 667 6522; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2006)25:2723-2734https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601152 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The family of myc proto-oncogenes encodes transcription factors (c-, N-, and L-Myc) that regulate cell growth and proliferation and are involved in the etiology of diverse cancers. Myc proteins are thought to function by binding and regulating specific target genes. Here we report that Myc proteins are required for the widespread maintenance of active chromatin. Disruption of N-myc in neuronal progenitors and other cell types leads to nuclear condensation accompanied by large-scale changes in histone modifications associated with chromatin inactivation, including hypoacetylation and altered methylation. These effects are largely reversed by exogenous Myc as well as by differentiation and are mimicked by the Myc antagonist Mad1. The first chromatin changes are evident within 6 h of Myc loss and lead to changes in chromatin structure. Myc widely influences chromatin in part through upregulation of the histone acetyltransferase GCN5. This study provides the first evidence for regulation of global chromatin structure by an oncoprotein and may explain the broad effects of Myc on cell behavior and tumorigenesis. Introduction The members of the Myc/Mad/Mnt superfamily of basic helix–loop–helix zipper (bHLHZ) transcription factors each heterodimerize with the bHLHZ protein Max and bind the E-box sequence CACGTG. Transcriptional activation by Myc proteins and repression by Mad/Mnt proteins, at E-box binding sites, are involved in regulation of cell growth, proliferation, and apoptosis (Eisenman, 2001). Targeted disruption of c-myc, N-myc, or max in the mouse leads to embryonic lethality (Stanton et al, 1992; Davis et al, 1993; Shen-Li et al, 2000), whereas overexpression of myc genes is strongly associated with the genesis of diverse cancers in many species (Lutz et al, 2002). Myc activates transcription through recruitment of chromatin-modifying complexes. For example, interaction with the coactivator TRRAP mediates Myc's association with histone acetyltransferases (HATs) GCN5 and Tip60 (McMahon et al, 1998, 2000; Frank et al, 2003). Myc also interacts with CBP and the chromatin-remodeling complex containing Ini1 (Cheng et al, 1999; Vervoorts et al, 2003). By contrast, Mad proteins recruit histone deacetylases (HDACs) via the corepressor mSin3 (Ayer, 1999; Knoepfler and Eisenman, 1999). The complexes recruited by Myc–Max and Mad–Max induce distinct chromatin modifications within the regulatory regions of shared target genes, leading to activation or repression (Eisenman, 2001; Frank et al, 2001; Fernandez et al, 2003). The notion that Myc is a typical transcription factor regulating the expression of a small number of target genes has been challenged by recent findings indicating that DNA binding and gene regulation by Myc are both surprisingly widespread (Fernandez et al, 2003; Li et al, 2003; Orian et al, 2003; Cawley et al, 2004; Patel et al, 2004). To study potential global gene regulatory functions of Myc, we focused on myc loss-of-function mutations in cells and tissues normally dependent on Myc activity. Results Altered nuclei and histone modifications in N-myc null cells We previously demonstrated that N-myc is essential for normal nervous system development (Knoepfler et al, 2002) by using nestin-cre to generate a nervous system-specific conditional knockout of N-myc in the mouse (N-myc NS null). In N-myc NS null E12.5 embryos, we observed that neural stem and progenitor cell (NPC) nuclei were abnormally small, round, and dark when stained with either H&E or methyl green (compare control and N-myc null nuclei in Figure 1Ai–ii and Supplementary Figure S1A). Both TUNEL and caspase cleavage assays demonstrated that these changes are not due to increased apoptosis in the N-myc null tissues and cells (Knoepfler et al, 2002) (Supplementary Figure S2A and B), and assays for senescence-associated β-gal activity indicated that they are not due to senescence (Supplementary Figure S2C). We therefore examined whether the changes in nuclear morphology might reflect alterations in chromatin. Figure 1.Analysis of N-Myc levels and histone acetylation. (A) E12.5 Sagittal sections from control (panels i and v), N-myc null (panels ii and vi), and N-myc transgenic embryos (Tg) expressing moderately (iii and vii) and highly elevated levels of N-Myc (iv and viii) under control of the nestin promoter/enhancer. Embryos were stained for N-Myc (brown stain, panels i–iv) and AcH3 (brown stain; panels v–viii) and counterstained with methyl green (bluish). Nuclear and cytoplasmic N-Myc proteins are evident, as has been previously reported (Wakamatsu et al, 1993) (× 100 magnification). Boxed regions are shown at higher magnification in Supplementary Figure S1A. (B) CGNPs derived from N-mycflox/flox (left three columns) or c-mycflox/flox (right column) embryos were grown in medium containing Shh (3 ng/ml), infected with GFP or Cre-IRES-GFP retroviruses, and stained with DAPI and anti-AcH3. White arrows denote infected cells. (C–F) Control and nestin-cre-derived N-myc null CGNPs stained for DAPI (blue) and histone H3 diMeK9 (C), triMeK4 (D), and triMeK9 (E) (red). (F) Control and N-myc null CGNPs stained for DAPI (blue) and HP1α (monochrome). (G) Cultured E12.5-derived control and N-myc null neurospheres stained for DNA (DAPI), N-Myc (green), and AcH3 (red). Columns 3 and 4 represent null cells transfected with N-Myc. White arrow indicates untransfected cell. Yellow arrows indicate NPCs with supraphysiological levels of N-Myc. Control (flox/flox) and null (flox/flox nestin-cre) cultures were grown for at least 1 month before these analyses and exhibited a high degree of stability in culture composition and properties (extremely low, but similar rates of spontaneous differentiation, stable proliferation rates, stable neurosphere morphology and size, and stable cellular morphology upon growth as a monolayer). We consistently observed that 80–90% of the N-mycflox/flox nestin-cre+ neurosphere cells exhibited a complete loss of detectable N-Myc protein. Download figure Download PowerPoint Transcriptional activity of chromatin is associated with specific histone modifications, including acetylation and methylation (Strahl and Allis, 2000), implicated in local gene-specific effects as well as global chromatin structure (Vogelauer et al, 2000; Rea et al, 2000; Berger and Felsenfeld, 2001; Kurdistani et al, 2004; Schubeler et al, 2004). To determine if disruption of Myc function induces changes in histone modifications consistent with chromatin inactivation, we first employed immunohistochemistry (IHC) to assess global levels of acetylated histone H3 and H4 (AcH3, AcH4) in the developing nervous system of control, N-myc NS null (Knoepfler et al, 2002), and nestin-N-myc transgenic (Tg) E12.5 embryos (Figure 1Av–viii). In these IHC studies, anti-AcH3 staining is K9 specific, whereas anti-AcH4 staining recognizes H4 acetylated at K5, K8, K12, and K16. Acetylation of each of these lysines is associated with active chromatin (Turner et al, 1992; Jeppesen and Turner, 1993; Braunstein et al, 1996). In the ventricular zone (VZ) of control embryos, we noted a positive correlation between nuclear size and the levels of N-Myc, AcH3, and AcH4 (Figure 1Ai and v and Supplementary Figure S1A and C). N-myc null NPCs exhibited striking histone hypoacetylation (low/absent brown stain) specifically associated with abnormally small round nuclei that also counterstained darkly with the DNA dye methyl green, suggesting chromatin condensation (Figure 1Ai–ii and v–vi). We next asked whether acute disruption of N-myc would also alter histone acetylation. Using cultured N-mycflox/flox cerebellar granule neural progenitors (CGNPs), N-myc was acutely disrupted by infection with MSCV Cre-IRES-GFP (Cre-GFP), a retroviral vector expressing Cre and GFP (Figure 1B). Disruption of N-myc in a majority of GFP+ cells was verified by immunofluorescence staining (IF) for endogenous nuclear N-Myc protein (not shown), similar to the large fraction of cells with N-myc loss in CGNPs with nestin-cre-driven knockout (Supplementary Figure S3A). N-Myc-deficient GFP+ CGNPs exhibit dramatic changes in histone acetylation, with the majority having an apparently complete loss of detectable histone H3 and H4 acetylation (Figure 1B, white arrows in column 3; data not shown). These changes are associated with nuclear condensation and alterations in DAPI staining (see below). Importantly, Cre-GFP virus had no effect on histone acetylation in c-mycflox/flox (de Alboran et al, 2001) CGNPs, consistent with the report that c-myc is not expressed in CGNPs (Kenney et al, 2003) (Figure 1B). Further, infection of N-mycflox/flox CGNPs with MSCV IRES-GFP virus, which only expresses GFP, had no effect on acetylation or nuclear structure (Figure 1B, column 1). Disruption of N-myc also does not appear to influence CGNP identity or culture composition. Control and null CGNP cultures exhibit essentially identical fractions (84–87%) of cells staining with the CGNP-specific marker Zic1 (Aruga et al, 1994) (Supplementary Figure S3B). Our data indicate that loss of Myc from neuronal progenitors is associated with significantly decreased levels of H3 and H4 acetylation. Myc is required for maintenance of normal histone methylation patterns To determine whether the decreased histone acetylation observed in N-myc null cells correlates with altered histone methylation patterns (Rea et al, 2000), we began by staining CGNPs for methylated H3-K9. Control (N-mycflox/flox) CGNPs displayed only faint speckled staining for both H3-diMeK9 (Figure 3A, top panel of column 8, and Figure 1C) and H3-triMeK9 (Figure 1E), marks of repressive chromatin. In contrast, we found that N-myc null (N-mycflox/flox nestin-cre) CGNPs exhibited high levels of H3-diMeK9 and H3-triMeK9 (Figures 1C, E, and 3A, column 8). Moreover, N-myc null CGNPs show a dramatic reduction in H3-triMeK4, a modification strongly associated with active chromatin (Strahl and Allis, 2000) (Figure 1D). We see the same general pattern of histone methylation changes in Tet-Off Myc B cells (Supplementary Figure S4) and, to a lesser extent, in c-myc null fibroblasts (not shown). The heterochromatin binding protein HP1α, which has been shown to directly interact with H3-MeK9 (Bannister et al, 2001; Lachner et al, 2001), exhibits a focal nuclear staining pattern evident in control CGNPs (Figure 1F) similar to that reported in other studies (Lachner et al, 2001). Consistent with their high levels of H3-di-MeK9 and H3-tri-MeK9, N-myc null CGNPs exhibit unusually intense and abundant HP1α foci (Figure 1F), presumably reflecting abnormal spreading of heterochromatin (see below). In summary, our targeted deletion experiments indicate that an apparently general loss of histone acetylation, increased histone methylation, and chromatin condensation in the N-myc null CGNPs are associated with loss of N-myc. Figure 2.Histone modifications in c-myc null, mad1–transfected, and WT fibroblasts. (A) Staining for AcH4 (red) in parental (TGR), c-myc null (HO15.19), and c-myc null rat fibroblasts stably transfected with c-myc. (B) Mad1 overexpression in WT murine fibroblasts partially phenocopies loss of Myc. (C) Immunoblotting for the indicated acetylated and methylated histones H3 and H4 comparing levels in TGR, c-myc null, and c-myc null rat fibroblasts transfected with c-myc. Values in the graphs represent the ratio of arbitrary values measured by Odyssey system for bands representing modified/total histones from three independent biological repeats. (D, E) Mass spectrometric data on total and K-specific histone H4 N-terminal acetylation from three independent experiments. The relative fraction of N-terminal peptides containing 0–4 acetyl groups was determined as well as the fraction of specific K residues that were acetylated. All error bars in this figure are s.e.m. Download figure Download PowerPoint Figure 3.Histone modifications, heterochromatin, and DNA accessibility in control and null N-myc CGNPs. (A) N-mycflox/flox nestin-cre CGNPs were visually sorted by nuclear size following staining with the indicated antibodies. Each color intensity in column 6 was uniformly increased in each panel to maximize detection of potential colocalization of signal. (B) Control (top) and N-myc null (bottom) CGNPs were analyzed by EM following uranyl acetate staining (panels i and iii–vi) or by DAPI (panel ii). Arrows indicate heterochromatic regions. Note: Although the scale bar in panel (i) is 2 μm and the bars in the other panels are 1 μm, the bar in (i) is also twice as long as the bars in the other panels, indicating that all images are exactly of the same magnification. (C) MNase assay on Tet-off Myc B cells with and without 72 h of tetracycline treatment. Download figure Download PowerPoint Reintroduction of Myc restores altered histone acetylation in N-myc null cells To ascertain if the decreased levels of histone acetylation represent an irreversible cellular response to N-Myc loss, we examined N-myc null (N-mycflox/flox nestin-cre+) neurosphere cultures derived from E12.5 whole embryonic brains. Overall IF analysis indicated that such N-myc null neurosphere cultures exhibited very low or undetectable nuclear histone acetylation compared to N-mycflox/flox controls (Figure 1G, columns 1 and 2). Introduction of N-Myc (Figure 1G, columns 3 and 4, and Figure 5G) or c-Myc (data not shown) into null cells resulted in markedly increased acetylation within 2 days of transfection. In the subset of N-myc null neurospheres, which expressed supraphysiological levels of introduced N-Myc, histone acetylation increased to substantially above normal (Figure 1G, yellow arrows). In addition, VZ cells in N-myc Tg mice displayed above-normal H3 and H4 acetylation (Figure 1Aiii, iv, vii, and viii and Supplementary Figure S1B) consistent with the notion that Myc levels are linked to the extent of histone acetylation. Such N-myc overexpression and hyperacetylation is also associated with VZ hyperplasia (Supplementary Figure S1B). Restoration of histone acetylation is strongly attenuated in N-myc null neurospheres transfected with N-myc mutants lacking Myc Box II (MBII), a highly conserved transactivation domain that associates with the HAT-binding coactivator TRRAP (McMahon et al, 2000), or lacking the C-terminal basic region, which is required for DNA binding (Supplementary Figure S10). We note that overexpression of the transcription factor E2F had no apparent effect on widespread histone acetylation (Supplementary Figure S9). Figure 4.Differentiation of control and N-myc null neurospheres influences histone modifications. IF staining of control and N-myc null neurospheres induced to differentiate for 7 days by growth factor withdrawal and retinoic acid treatment. Download figure Download PowerPoint Figure 5.GCN5 is a direct Myc target gene and can reverse histone hypoacetylation in N-myc null cells. (A, B) Shutting off Myc in the Tet-repressor Myc B cells leads to a reduction in GCN5 levels, but has no effect on the levels of other HATs, HDACs, and HMTs as indicated by IF (monochrome) and immunoblot with antisera against the indicated protein. (C, D) shRNA-mediated KD of endogenous Myc results in decreased hGCN5 mRNA levels. Treatment of the human lung cancer cell line H1299 for 48 h with shRNA directed against Myc (shMyc) results in decreased levels of Myc mRNA and protein, whereas a scrambled shRNA (shScr) had no effect. Concomitant with the loss of Myc expression is the loss of hGCN5 at both the protein and mRNA level. (E) Myc activates transcription of the hGCN5 gene in primary human cells. The human diploid fibroblast strain IMR90 was stably transduced with a retrovirus directing expression of the Myc-ER protein. Myc-ER-expressing cells were treated with 4-OHT (or EtOH as a negative control) to activate c-Myc for the times indicated. mRNA was harvested and analyzed by quantitative RT–PCR. Actin mRNA levels were determined simultaneously and used to normalize mRNA levels for the other genes. hGCN5 levels are increased by Myc activation even more dramatically than those of the known Myc targets CAD and cyclin D2. Furthermore, mRNA for the other TRRAP-associated HATs, PCAF and TIP60, were not responsive to Myc activation. The non-Myc responsive gene ELF1a was used as a negative control. Values are expressed as fold induction. (F) Direct binding of endogenous Myc to the hGCN5 locus in vivo. The human GCN5 locus contains two matches to the CACGTG consensus Myc binding site as indicated. In addition, several matches to the non-canonical site bound by Myc in the cytochrome c gene (CATGCG) are present. To examine the binding of Myc to these sites, we utilized human diploid fibroblasts that had been either serum deprived or re-fed with 10% FCS for 2 h. Binding of endogenous Myc to three sites within the hGCN5 locus was then assessed. Inducible binding of Myc to site 2, which is adjacent to the transcriptional start site, was evident. (G) Overexpression of hGCN5 in N-myc null neurospheres reverses histone hypoacetylation as effectively as reintroduction of N-myc. Null neurospheres were transfected with N-myc or hGCN5 (red), then IF stained for acetylation of histone H3 (green). Download figure Download PowerPoint Quantitative analysis of chromatin changes Because quantitative analyses require more chromatin than can be readily obtained from our primary murine neuronal cell cultures, we turned to the well-characterized c-myc null rat fibroblast cell line, HO15.19 (Mateyak et al, 1997). As in the neuronal cells, HO15.19 cells lacking c-myc (hereafter ‘c-myc null’ and which do not express N- or L-myc) (Mateyak et al, 1997) are hypoacetylated at H3 and H4 compared to the TGR wild-type (WT) parental control line when assayed by IF (Figure 2A; data not shown). Reintroduction of c-Myc into the c-myc null cells increases histone acetylation levels to WT (Figure 2A). In three independent immunoblotting experiments, loss of c-myc resulted in approximately two-fold reductions in AcH3 and AcH4 compared to total histone levels, whereas there were no consistent changes in total histone levels associated with myc status. These reductions are largely reversed following reintroduction of c-myc (Figure 2C). Loss of detectable c-Myc protein in the c-myc nulls and its restoration in the cells with reintroduced c-Myc have been previously verified (Mateyak et al, 1997; Shiio et al, 2002). Histone modification changes associated with loss of myc were also studied by mass spectrometric (MS) analysis of acid extracts from parental control TGR cells and c-myc null fibroblasts (Figure 2D and E). MS analysis of cumulative H4 acetylation at K5, 8, 12, and 16 was consistent with widespread histone hypoacetylation in the c-myc null cells (Figure 2D and E). The level of completely unmodified H4 peptide was approximately 20% higher in nulls, which also exhibited a nearly 20% reduction in monoacetylation. Histone H4 isolated from nulls had approximately two-fold reductions in di, tri-, and tetra-acetylation. Thus, the overall degree of decreased H4 acetylation in nulls determined by MS and immunoblotting is comparable (Figure 2C). We next examined site-specific acetylation in controls and nulls and found decreased acetylation of all four lysine residues in the nulls (Figure 2E). The site-specific and total lysine acetylation MS data taken together suggest that the histone H4 hypoacetylation that results from loss of Myc is primarily due to a loss of 1–2 acetyl groups, predominantly from K12 and K16, from poly-acetylated histone H4 leading to a shift toward mono- and unacetylated H4 amino-termini. Myc influences global histone modification, nuclear size, and heterochromatin We consistently observe a correlation between levels of N-Myc, nuclear size, and acetylated H3 and H4 in neural progenitors. Figure 3A shows conditional knockout (N-mycFL/FL nestin-cre) CGNPs arranged in the order of decreasing nuclear size. Varying levels of residual N-Myc protein remain in a small subset of these conditionally null CGNPs and N-Myc level correlates with nuclear size and histone acetylation (Figure 3A, columns 1–6; data not shown). These findings suggest that loss of histone acetylation parallels decreasing levels of Myc (column 6). This notion is also supported by the observation that in cultures of conditionally null CGNPs, the small subset with residual N-Myc levels are the only ones with remaining detectable, albeit low, levels of histone acetylation (Supplementary Figure S3A). Interestingly, the subnuclear localization pattern of N-Myc broadly overlaps with regions of anti-AcH3 and anti-AcH4 IF, all of which are excluded from islands of intense DAPI staining (Figure 3A, column 6), characteristic of heterochromatin (Bickmore and Craig, 1997). Also evident is a correlation between H3-diMeK9 levels, decreased nuclear size, and the extent of heterochromatic regions (Figure 3A, columns 7 and 8). A more detailed analysis of nuclear and DNA structure in control and N-myc null CGNPs was conducted using transmission electron microscopy (EM) of uranyl acetate-stained cells. As shown in Figure 3B, nuclei from control CGNPs are approximately 5–10 μm in diameter composed predominantly of lightly stained euchromatic regions, with the exception of 3–5 darkly staining heterochromatic regions (Busch, 1974) (arrows in Figure 3Bi). These darkly staining regions, each approximately 0.5–1 μm across, are frequently associated with the nuclear lamina, as expected for heterochromatin (Cohen et al, 2001). They are similar in size, location, and appearance to the intense DAPI foci in CGNPs (Figure 3B, white arrows in panel ii), which have been established to be heterochromatin in murine cells (Bickmore and Craig, 1997). In N-myc null CGNPs, the majority of nuclei are several fold smaller in area compared to controls and the heterochromatic regions are greatly expanded (Figure 3Biii–v). Thus, loss of Myc results in a decrease in nuclear volume and a striking spreading of heterochromatin, no longer limited to foci, throughout the nuclei of null cells. Loss of Myc leads to decreased DNA accessibility To address whether myc levels influence chromatin structure, we conducted micrococcal nuclease (MNase) accessibility assays (Weintraub and Groudine, 1976) using the well-established Tet-Off Myc B (P493-6) cell system (Schuhmacher et al, 1999) in which Myc can be reproducibly turned off by the addition of tetracycline. The P493-6 cells exhibit the same type of chromatin changes upon Myc downregulation as observed in myc-deficient neuronal cells and fibroblasts (see below). Intact living cells were permeabilized so as to minimize effects on chromatin structure (Zaret, 1999) and cells were treated with increasing amounts of MNase (Figure 3C). In the absence of MNase, neither Myc-Off nor Myc-On cells exhibited evidence of endogenous nuclease activity. However, at increasing concentrations of MNase, Myc-Off cells exhibited a strongly enhanced resistance to MNase, indicative of a more closed chromatin structural state (Shogren-Knaak et al, 2006). We have observed decreased accessibility following Myc loss in four independent experiments in these cells. Thus, Myc appears to influence DNA accessibility, consistent with the histone modifications described above. These data support the notion that Myc has a widespread influence on chromatin structure. Loss of Myc rapidly alters histone modifications in a cell cycle- and differentiation-independent manner To assess the kinetics of chromatin changes associated with loss of Myc, we analyzed Tet-Off Myc B cells (Schuhmacher et al, 1999) in which introduction of tetracycline shuts down c-Myc expression. Expression of endogenous Myc proteins is undetectable in these cells, and introduction of tetracycline rapidly (within 16 h) leads to strong downregulation of the c-Myc transgene (Grandori et al, 2003). Introduction of tetracycline for 72 h in a serum-free context resulted in loss of Myc (data not shown) as well as the same general pattern of changes we observed in neuronal cells and fibroblasts upon Myc disruption: decreased histone H3 K9 acetylation and K4 methylation as well as increased levels of H3-diMeK9, and nuclear condensation (Supplementary Figure S4; not shown). Initial changes were detectable as early as 6 h after introduction of tetracycline (Supplementary Figure S4) and downregulation of Myc (data not shown), whereas more substantial changes were evident after 24 and 72 h. Thus, changes in histone modifications occur rapidly following alterations in Myc levels. Further, the changes in chromatin do not appear to be secondary to changes in cell cycle status because the chromatin alterations are observed with loss of Myc in a system in which there are no cycling cells (serum-free conditions) (Schuhmacher et al, 1999). Several additional lines of evidence argue against the possibility that the changes in histone modifications are secondary consequences of cell cycle arrest upon Myc loss. The c-myc null HO15.19 fibroblasts, which exhibit decreased acetylation (Figure 2), proliferate, albeit at a lower rate (Mateyak et al, 1997). Similarly, nestin-cre-derived N-myc null and WT CGNPs express Ki67 (Supplementary Figure S5C), a nuclear antigen present in cycling but not quiescent cells (Gerdes et al, 1991). Furthermore, we found that a subset of N-myc null CGNPs, even those with the most extreme nuclear condensation and histone hypoacetylation, nonetheless exhibited anti-BrdU and anti-phosphoH3 staining (Supplementary Figure S5A and B; data not shown). We have also observed that differentiation of neurospheres and CGNPs, associated with terminal cell cycle arrest, leads to increased histone acetylation and decreased H3-K9 methylation (Figure 4; not shown). Furthermore, a recent study indicates that quiescent lymphocytes exhibit a striking decrease in repressive histone methylation marks compared to activated, proliferating cells (Baxter et al, 2004). Taken together, these data argue that the changes observed upon Myc loss of function are not simply a consequence of proliferation arrest. The Myc antagonist Mad1 suppresses widespread histone acetylation: a role for the global balance of HDACs and HATs Mad-related proteins exhibit widespread genomic binding in Drosophila overlapping with dMyc binding sites (Orian et al, 2003) and antagonize some Myc functions through shared target genes in mammalian cells (Iritani et al, 2002). We asked whether Mad1 also influences widespread chromatin modification. Mad1 overexpression in control neurospheres (not shown) and murine fibroblasts resulted in a pronounced reduction in global AcH4 (Figure 2B) and AcH3 (not shown) levels in both cell types. Furthermore, deletion of the Mad1 SID domain (Mad1ΔSID), which constitutes

High-throughput technologies can now identify hundreds of candidate protein biomarkers for any disease with relative ease. However, because there are no assays for the majority of proteins and de novo immunoassay development is prohibitively expensive, few candidate biomarkers are tested in clinical studies. We tested whether the analytical performance of a biomarker identification pipeline based on targeted mass spectrometry would be sufficient for data-dependent prioritization of candidate biomarkers, de novo development of assays and multiplexed biomarker verification. We used a data-dependent triage process to prioritize a subset of putative plasma biomarkers from >1,000 candidates previously identified using a mouse model of breast cancer. Eighty-eight novel quantitative assays based on selected reaction monitoring mass spectrometry were developed, multiplexed and evaluated in 80 plasma samples. Thirty-six proteins were verified as being elevated in the plasma of tumor-bearing animals. The analytical performance of this pipeline suggests that it should support the use of an analogous approach with human samples.

Abstract Despite advances in proteomic technologies, clinical translation of plasma biomarkers remains low, partly due to a major bottleneck between the discovery of candidate biomarkers and downstream costly clinical validation studies. Due to a dearth of multiplexable assays, generally only a few candidate biomarkers are tested, and the validation success rate is accordingly low. Here, we demonstrate the capability of internal standard triggered-parallel reaction monitoring (IS-PRM) to prioritize candidate biomarkers for validation studies. A 5,176-plex assay coupling immunodepletion and fractionation with IS-PRM was developed and implemented in human plasma to quantify peptides representing 1,314 breast cancer biomarker candidates. Compared to prior approaches using data-dependent analysis, IS-PRM showed improved sensitivity (912 vs 295 proteins quantified) and precision (CV 0.1 vs 0.27) enabling rank-ordering of candidate biomarkers for validation studies. The assay greatly expands capabilities for quantification of large numbers of proteins and is well suited for prioritization of viable candidate biomarkers.

Abstract Cells rely on activity-dependent protein-protein interactions to convey biological signals, but the state-dependent interactome is notoriously cell-specific and undercharacterized 1 . In the case of chimeric antigen receptor (CAR) T cells containing a 4-1BB costimulatory domain, receptor engagement is thought to trigger the formation of protein complexes similar to those triggered by T cell receptor (TCR)-mediated signaling, but the number and type of protein-interaction-mediating binding domains differ between CARs and TCRs. Here, we performed co-immunoprecipitation mass spectrometry of a 2 nd generation CD19-directed 4-1BB:zeta CAR (referred to as bbζCAR) and identified 67 proteins that increased their co-association after target engagement. We compared activity-induced TCR and CAR signalosomes using quantitative multiplex co-immunoprecipitation and showed that bbζCAR engagement leads to activation of two modules of protein interactions, one similar to TCR signaling that is more weakly engaged in bbζCAR vs. TCR, and one composed of TRAF signaling complexes that is not engaged by the TCR. Batch-to-batch and inter-individual variations in IL2 production correlated with differences in the magnitude of protein network activation. Future CAR T cell manufacturing protocols could measure, and eventually control, biological variation by monitoring these signalosome activation markers. One Sentence Summary We define a network of protein interactions engaged by chimeric antigen receptors following target binding, and show that the magnitude of network activation correlates with IL-2 secretion, a proxy measure for CAR T cell function.

Abstract T cell receptor (TCR)-T cell immunotherapy, in which T cells are engineered to express a TCR specific for a tumor epitope, is a form of adoptive cell therapy (ACT) that has demonstrated promise against various tumor types. Mutants of oncoprotein KRAS, particularly at glycine-12 (G12), are frequent drivers of tumorigenicity, but also attractive targets for TCR-T cell therapy. However, MHC class I-restricted TCRs specifically targeting G12-mutant KRAS epitopes in the context of tumors expressing HLA-A2, the most common human HLA-A allele, have remained elusive despite evidence that an epitope encompassing the mutation can bind HLA-A2 and induce T cell responses. We report that post-translational modifications of the protein on this epitope may allow tumor cells to evade immunologic pressure from TCR-T cells. A lysine side chain-methylated KRAS G12V peptide, rather than unmodified epitope, may be presented in HLA-A2 by tumor cells and impact recognition by TCRs. Using a novel computationally guided approach to design TCRs, we developed by mutagenesis TCRs that recognize this methylated peptide, enhancing tumor recognition and destruction. Additionally, we identified TCRs with similar functional activity in normal repertoires from rare primary T cells by stimulation with modified peptide, clonal expansion, and selection. Mechanistically, a gene knockout screen to identify mechanism(s) by which tumor cells methylate or demethylate this epitope unveiled SPT6 as a demethylating protein that could be targeted to improve effectiveness of these TCRs. These findings highlight the role of post-translational modifications in immune evasion and suggest that identifying and targeting such modifications should facilitate development of more effective TCR-T cell therapies.

The maternal-to-zygotic transition (MZT) is a conserved developmental process where the maternally-derived protein and mRNA cache is replaced with newly made zygotic gene products. We have previously shown that in

DUX4 is a transcription factor whose misexpression in skeletal muscle causes facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD). While DUX4's transcriptional activity has been extensively characterized, the DUX4-induced proteome remains undescribed. Here, we report concurrent measurement of RNA and protein levels in DUX4-expressing cells via RNA-seq and quantitative mass spectrometry. DUX4 transcriptional targets were robustly translated, confirming the likely clinical relevance of proposed FSHD biomarkers. However, a multitude of mRNAs and proteins exhibited discordant expression changes upon DUX4 expression. Our dataset revealed unexpected proteomic, but not transcriptomic, dysregulation of diverse molecular pathways, including Golgi apparatus fragmentation, as well as extensive post-transcriptional buffering of stress response genes. Key components of RNA degradation machinery, including UPF1, UPF3B, and XRN1, exhibited suppressed protein, but not mRNA, levels, explaining the build-up of aberrant RNAs that characterizes DUX4-expressing cells. Our results provide a resource for the FSHD community and illustrate the importance of post-transcriptional process to DUX4-induced pathology.