Abstract Individuals with Alzheimer’s Disease (AD) experience circadian rhythm disorder. The circadian rhythm is synchronized by a master clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN), which is a tiny hypothalamic nucleus. Little is known about the molecular and pathological changes that occur in the SCN during AD progression. We examined postmortem brains of 12 controls without AD neuropathological changes (Braak stage 0) and 36 subjects at progressive Braak stages (I, II, and VI). To investigate potential AD-specific changes, we measured the neuronal counts of arginine vasopressin (AVP) and vasoactive intestinal peptide (VIP) positive neurons, along with the Braak stages in the SCN. We investigated in adjacent hypothalamic nuclei which are also composed of AVP+ neurons but show more resilience to AD: paraventricular nucleus (PVN) and supraoptic nucleus (SON). To understand the dysregulated proteins associated to AD progression, we performed in-situ proteomics, investigating 57 proteins, including commonly dysregulated in AD, using GeoMx Digital Spatial Profiling (DSP) in the three nuclei (total of 703 area of interests). Neurofibrillary tangles (NFTs) and tau fibrils were found selectively in SCN. We failed to detect NFTs in SON, only a mild dysregulation of p-tau at Braak VI in PVN and SON. Amyloid plaque was absent in the SCN and SON. Additionally, the SCN showed increased glial proteins already at Braak stage I, whereas the level of these proteins sustained in the other nuclei. The SCN is exclusively vulnerable to AD-tau pathology and show immune dysregulation even at Braak I but is protected against amyloid plaque. This finding revealed selectively in amnestic AD, showing more resilience in AD variant. This tau-related molecular dysregulation in the SCN contributes to circadian rhythm disturbances in AD, a phenomenon observed before the onset of cognitive disorder.

Abstract Drugs acting as positive allosteric modulators (PAMs) to enhance the activation of the calcium sensing receptor (CaSR) and to suppress parathyroid hormone (PTH) secretion can treat hyperparathyroidism but suffer from side effects including hypocalcemia and arrhythmias. Seeking new CaSR modulators, we docked libraries of 2.7 million and 1.2 billion molecules against transforming pockets in the active-state receptor dimer structure. Consistent with simulations suggesting that docking improves with library size, billion-molecule docking found new PAMs with a hit rate that was 2.7-fold higher than the million-molecule library and with hits up to 37-fold more potent. Structure-based optimization of ligands from both campaigns led to nanomolar leads, one of which was advanced to animal testing. This PAM displays 100-fold the potency of the standard of care, cinacalcet, in ex vivo organ assays, and reduces serum PTH levels in mice by up to 80% without the hypocalcemia typical of CaSR drugs. Cryo-EM structures with the new PAMs show that they induce residue rearrangements in the binding pockets and promote CaSR dimer conformations that are closer to the G-protein coupled state compared to established drugs. These findings highlight the promise of large library docking for therapeutic leads, especially when combined with experimental structure determination and mechanism. One sentence summary Structure-based virtual screening uncovers novel CaSR allosteric modulators with enhanced efficacy and less side effects.

Carbonic anhydrases (CAs) have been implicated in tumor progression particularly membrane bound CA isoform IX (CA IX). In contrast to CA IX, expression of CA XII, specifically in breast cancer, is associated with a better outcome despite performing the same catalytic function. In this study, we have structurally modeled the orientation of bound ureido-substituted benzene sulfonamides (USBs) within the active site of CA XII, in comparison to CA IX and cytosolic off-target CA II, to understand isoform specific inhibition. This has identified specific residues within the CA active site, which differ between isoforms that are important for inhibitor binding and isoform specificity. The affinity of these inhibitors are two to three orders of magnitude lower in breast cancer cells, that selectively express CA IX or CA XII, relative to recombinant CA proteins. However, we show significantly greater inhibition of CA IX activity over CA XII. While the inhibitors block cell growth, without inducing cell death, this occurs at two orders of magnitude above the Ki values for inhibition of CA IX and CA XII in their respective cell types. Surprisingly, the USBs inhibited cell growth even in cells in which CA IX and CA XII expression was ablated. Despite the potential for these sulfonamides as chemotherapeutic agents, these data suggest that we reconsider the role of CA activity on growth inhibition.

Background Sleep-wake dysfunction is an early and common event in Alzheimer’s disease (AD). The lateral hypothalamic area (LHA) regulates the sleep and wake cycle through wake-promoting orexinergic neurons (Orx N ) and sleep-promoting melanin-concentrating hormone or MCHergic neurons (MCH N ). These neurons share close anatomical proximity with functional reciprocity. This study investigated LHA Orx N and MCH N loss patterns in AD individuals. Understanding the degeneration pattern of these neurons will be instrumental in designing potential therapeutics to slow down the disease progression and remediate the sleep-wake dysfunction in AD. Methods Postmortem human brain tissue from donors with AD (across progressive stages) and controls were examined using unbiased stereology. Formalin-fixed, celloidin-embedded hypothalamic sections were stained with Orx-A/MCH, p-tau (CP13), and counterstained with gallocyanin. Orx or MCH-positive neurons with or without CP13 inclusions and gallocyanin-stained neurons were considered for stereology counting. Additionally, we extracted RNA from the LHA using conventional techniques. We used customized Neuropathology and Glia nCounter ® (Nanostring) panels to study gene expression. Wald statistical test was used to compare the groups, and the genes were considered differentially expressed when the p-value was <.05. Results We observed a progressive decline in Orx N alongside a relative preservation of MCH N . Orx N decreased by 58% (p=.03) by Braak stages (BB) 1-2 and further declined to 81% (p=.03) by BB 5-6. Conversely, MCH N demonstrated a non-statistical significant decline (27%, p=.1088) by BB 6. We observed a progressive increase in differentially expressed genes (DEGs), starting with glial profile changes in BB2. While Orx N loss was observed, Orx-related genes showed upregulation in BB 3-4 compared to BB 0-1. GO and KEGG terms related to neuroinflammatory pathways were mainly enriched. Conclusions To date, Orx N loss in the LHA represents the first neuronal population to die preceding the loss of LC neurons. Conversely, MCHN shows resilience to AD p-tau accumulation across Braak stages. The initial loss of Orx N correlates with specific neuroinflammation, glial profile changes, and overexpression of HCRT, possibly due to hyperexcitation following compensation mechanisms. Interventions preventing Orx N loss and inhibiting p-tau accumulation in the LHA could prevent neuronal loss in AD and, perhaps, the progression of the disease.