The integrin αVβ3 receptor has been implicated in several important diseases, but no αVβ3 antagonists are approved for human therapy. One possible limitation of current small-molecule antagonists is their ability to induce a major conformational change in the receptor that induces it to adopt a high-affinity ligand-binding state. In response, we used structural inferences from a pure peptide antagonist to design the small-molecule pure antagonists TDI-4161 and TDI-3761. Both compounds inhibit αVβ3-mediated cell adhesion to αVβ3 ligands, but do not induce the conformational change as judged by antibody binding, electron microscopy, X-ray crystallography, and receptor priming studies. Both compounds demonstrated the favorable property of inhibiting bone resorption in vitro , supporting potential value in treating osteoporosis. Neither, however, had the unfavorable property of the αVβ3 antagonist cilengitide of paradoxically enhancing aortic sprout angiogenesis at concentrations below its IC50, which correlates with cilengitide’s enhancement of tumor growth in vivo .Significance Statement αVβ3 is a potential therapeutic target for several important human diseases, but there are currently no αVβ3 antagonists approved for human therapy. Current candidates are primarily based on the Arg-Gly-Asp (RGD) motif and act as partial agonists in that they induce αVβ3 to undergo a conformational change that converts it into a high-affinity ligand-binding state. We have used structure-guided design to produce pure small-molecule αVβ3 antagonists that do not induce the conformational change as judged by protein crystallography, electron microscopy, and receptor priming. These compounds inhibit αVβ3-mediated bone resorption in vitro , but unlike the partial agonist cilengitide, do not enhance angiogenesis at low doses, a property that correlates with low-dose cilengitide’s enhancement of tumor growth in vivo . These pure αVβ3 antagonists can help define αVβ3’s role in animal models. If they demonstrate benefits over partial agonists in these model systems, they may be appropriate to consider for human therapy.

Venous thrombosis (VT) is a common vascular disease associated with reduced survival and a high recurrence rate. Previous studies have shown that the accumulation of platelets and neutrophils at sites of endothelial cell activation is a primary event in VT, but a role for platelet αIIbβ3 in the initiation of venous thrombosis has not been established. This task has been complicated by the increased bleeding linked to partial agonism of current αIIbβ3 inhibitory drugs such as tirofiban (Aggrastat). Here, we show that m-tirofiban, an engineered version of tirofiban, is not a partial agonist of αIIbβ3. This is based on its cryo-EM structure in complex with human full-length αIIbβ3 and its inability to increase expression of an activation-sensitive epitope on platelet αIIbβ3. m-tirofiban abolished agonist-induced platelet aggregation ex vivo at concentrations that preserved clot retraction and markedly suppressed the accumulation of platelets, neutrophils, and fibrin on thrombin-activated endothelium in real-time using intravital microscopy in a mouse model of venous thrombogenesis. Unlike tirofiban, however, m-tirofiban did not increase bleeding at the thrombosis-inhibitory dose. These findings establish a key role for αIIbβ3 in the initiation of VT, provide a guiding principle for designing potentially safer inhibitors for other integrins, and suggest that pure antagonists of αIIbβ3 like m-tirofiban merit further consideration as potential thromboprophylaxis agents in patients at high-risk for VT and hemorrhage.

A prevailing dogma is that effective inhibition of vascular thrombosis by therapeutic targeting of platelet integrin αIIbβ3 cannot be achieved without compromising hemostasis. The resulting serious bleeding and increased morbidity and mortality have limited use of current anti-αIIbβ3 drugs to high-risk cardiac patients. It is speculated that these adverse outcomes result from drug-induced conformational changes in αIIbβ3 but direct proof is lacking. We used structure-guided design to generate the ligand-mimetic peptide Hr10 and a modified form of the partial agonist drug Tirofiban that now act as “pure” orthosteric antagonists of αIIbβ3, i.e. they no longer induce the conformational changes in αIIbβ3 and also suppress these changes in presence of agonists. Both agents inhibited human platelet aggregation effectively but without interfering with clot retraction. When tested in a humanized mouse model of thrombosis predictive of clinical efficacy, Hr10 was as effective as the αIIbβ3 partial agonist peptide drug Eptifibatide in inhibiting arteriolar thrombosis, but in sharp contrast to Eptifibatide, Hr10 did not cause serious bleeding, establishing a causal link between partial agonism and impaired hemostasis. Pure orthosteric inhibitors of αIIbβ3 may thus offer safer alternatives for human therapy. Our structure-guided approach may also find utility in designing similar drug candidates targeting other integrins and in providing vital tools for further probing structure-activity relationships in integrins.