The acute toxicity of two degradable polymers, a 70:30 poly (l-d, l-lactide) (PLDLA) and a 90:10 poly(l-lactide-co-glycolide) (PLGA), was evaluated by the agar diffusion test and the filter test with L929 mouse fibroblasts. Extracts of the materials prepared in phosphate-buffered saline at 37 and 70 °C were assessed for mitochondrial succinate dehydrogenase activity by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT assay) and the incorporation of 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) into DNA of BALB 3T3 cells. Both materials revealed no signs of cytotoxicity during the agar diffusions and filter tests. In the MTT and BrdU assays PLDLA and PLGA showed similar results. Cells treated with extracts prepared at 37 °C caused slight stimulation of mitochondrial activity. In contrast, cells incubated with the 70 °C media revealed a concentration-dependent decrease of mitochondrial activity. DNA synthesis was significantly decreased by the 37 °C extracts. As in the MTT assay, the effect of the extracts prepared at 70 °C was significantly greater. From these in vitro results it is suggested that PLDLA and PLGA have satisfactory biocompatibility. High concentrations of the degradation products, however, had a toxic influence on the cell culture systems used.

Damage of cartilage structures in the head and neck region as well as in orthopedic sites are frequently caused by trauma, tumor resection, or congenital defects. Despite a high demand in many clinical fields, until today, no adequate cartilage replacement matrix is available for these fields of application. Materials that are clinically applied for joint cartilage repair still need optimization due to difficult intraoperative handling and risk of early mechanical damage. We have developed and applied a novel chemical process to completely decellularize and sterilize human and porcine cartilage tissues (meniscus cartilage and nasal septum) to generate a new type of bioimplant matrix. To characterize this matrix and to determine the effect of the decellularization process, the content of denatured collagen (wD) and the content of glycosaminoglycans (GAGs) (wG) were determined. Possible cytotoxic effects and cellular compatibility of the matrix in vitro have been examined by seeding processed cartilage biomatrices with human primary chondrocytes as well as murine fibroblasts (L929). Vitality and state of metabolism of cells were measured using MTS assays. Both cell types adhered to scaffold surfaces and proliferated. No areas of growth inhibition or cytotoxic effects were detected. New synthesis of cartilage-specific extracellular matrix was observed. By histological staining, electron microscopy, and μCT analysis, an increase of matrix porosity, complete cell elimination, and high GAG removal were demonstrated. Being from natural-origin, processed xenogenic and allogeneic cartilage biomatrices are highly versatile with regard to shape, size, and biomechanics, making them promising candidates for various biomedical applications.

Proper activation of macrophages (Mφ) in the inflammatory phase of acute wound healing is essential for physiological tissue repair. However, there is a strong indication that robust Mφ inflammatory responses may be causal for the fibrotic response always accompanying adult wound healing. Using a complementary approach of in vitro and in vivo studies, we here addressed the question of whether mesenchymal stem cells (MSCs)-due to their anti-inflammatory properties-would control Mφ activation and tissue fibrosis in a murine model of full-thickness skin wounds. We have shown that the tumor necrosis factor-α (TNF-α)-stimulated protein 6 (TSG-6) released from MSCs in co-culture with activated Mφ or following injection into wound margins suppressed the release of TNF-α from activated Mφ and concomitantly induced a switch from a high to an anti-fibrotic low transforming growth factor-β1 (TGF-β1)/TGF-β3 ratio. This study provides insight into what we believe to be a previously undescribed multifaceted role of MSC-released TSG-6 in wound healing. MSC-released TSG-6 was identified to improve wound healing by limiting Mφ activation, inflammation, and fibrosis. TSG-6 and MSC-based therapies may thus qualify as promising strategies to enhance tissue repair and to prevent excessive tissue fibrosis.

Abstract Singular blockade of C5a in experimental models of sepsis is known to confer protection by rescuing lethality and decreasing pro-inflammatory responses. However, the role of inhibiting C5a has not been evaluated in the context of sterile systemic inflammatory responses, like polytrauma and hemorrhagic shock (PT + HS). In our presented study, a novel and highly specific C5a L-aptamer, NoxD21, was used to block C5a activity in an experimental murine model of PT + HS. The aim of the study was to assess early modulation of inflammatory responses and lung damage 4 h after PT + HS induction. NoxD21-treated PT + HS mice displayed greater polymorphonuclear cell recruitment in the lung, increased pro-inflammatory cytokine levels in the bronchoalveolar lavage fluids (BALF) and reduced myeloperoxidase levels within the lung tissue. An in vitro model of the alveolar-capillary barrier was established to confirm these in vivo observations. Treatment with a polytrauma cocktail induced barrier damage only after 16 h, and NoxD21 treatment in vitro did not rescue this effect. Furthermore, to test the exact role of both the cognate receptors of C5a (C5aR1 and C5aR2), experimental PT + HS was induced in C5aR1 knockout (C5aR1 KO) and C5aR2 KO mice. Following 4 h of PT + HS, C5aR2 KO mice had significantly reduced IL-6 and IL-17 levels in the BALF without significant lung damage, and both, C5aR1 KO and C5aR2 KO PT + HS animals displayed reduced MPO levels within the lungs. In conclusion, the C5aR2 could be a putative driver of early local inflammatory responses in the lung after PT + HS.

Abstract Successful regeneration requires the coordinated execution of multiple cellular responses to injury. In amputated zebrafish fins, mature osteoblasts dedifferentiate, migrate towards the injury and form proliferative osteogenic blastema cells. We show that osteoblast migration is preceded by cell elongation and alignment along the proximodistal axis, which require actomyosin, but not microtubule turnover. Surprisingly, osteoblast dedifferentiation and migration can be uncoupled. Using pharmacological and genetic interventions, we found that NF-κB and retinoic acid signalling regulate dedifferentiation without affecting migration, while the complement system and actomyosin dynamics are required for migration but not dedifferentiation. Furthermore, by removing bone at two locations within a fin ray, we established a trauma model containing two injury sites. We found that osteoblasts dedifferentiate at and migrate towards both sites, while accumulation of osteogenic progenitor cells and regenerative bone formation only occur at the distal-facing injury. Together, these data indicate that osteoblast dedifferentiation and migration represent generic injury responses that are differentially regulated and can occur independently of each other and of regenerative growth. Successful bone regeneration appears to require the coordinated execution of generic and regeneration-specific responses of osteoblast to trauma. Abstract Figure

Background The complement system is locally activated after joint injuries and leads to the deposition of the terminal complement complex (TCC). Sublytic TCC deposition is associated with phenotypical alterations of human articular chondrocytes (hAC) and enhanced release of inflammatory cytokines. Chronic inflammation is a known driver of chondrosenescence in osteoarthritis (OA). Therefore, we investigated whether TCC deposition contributes to stress-induced premature senescence (SIPS) during aging in vivo and after ex vivo cartilage injury. Methods Femoral condyles of male 13-week-old and 72-week-old CD59-ko (higher TCC deposition), C6-deficient (insufficient TCC formation), and C57BL/6 (WT) mice were collected to assess age-related OA. Furthermore, macroscopically intact human and porcine cartilage explants were traumatized and cultured with/without 30% human serum (HS) to activate the complement system. Explants were additionally treated with clusterin (CLU, TCC inhibitor), N-acetylcysteine (NAC, antioxidant), Sarilumab (IL-6 receptor inhibitor), STAT3-IN-1 (STAT3 inhibitor), or IL-1 receptor antagonist (IL-1RA) in order to investigate the consequences of TCC deposition. Gene and protein expression of senescence-associated markers such as CDKN1A and CDKN2A was determined. Results In the murine aging model, CD59-ko mice developed after 72 weeks more severe OA compared to C6-deficient and WT mice. mRNA analysis revealed that the expression of Cdkn1a, Cdkn2a, Tp53, Il1b, and Il6 was significantly increased in the cartilage of CD59-ko mice. In human cartilage, trauma and subsequent stimulation with HS increased mRNA levels of CDKN1A, CDKN2A, and IL6, while inhibition of TCC formation by CLU reduced the expression. Antioxidative therapy with NAC had no anti-senescent effect. In porcine tissue, HS exposure and trauma had additive effects on the number of CDKN2A-positive cells, while Sarilumab, STAT-IN-1, and IL-1RA reduced CDKN2A expression by trend. Conclusion Our results demonstrate that complement activation and consequent TCC deposition is associated with chondrosenescence in age-related and trauma-induced OA. We provided evidence that the SIPS-like phenotype is more likely induced by TCC-mediated cytokine release rather than oxidative stress. Overall, targeting TCC formation could be a future approach to attenuate OA progression.

Acute injuries trigger an intense activation of the body's defense mechanisms aiming to limit damage and initiate healing. Among the crucial components of the intravascular immune system, the complement system plays a significant role in traumatic injuries, albeit often negatively. It has been suggested that excessive activation of the complement system, transitioning from a localized and timed response to a systemic one, can lead to a loss of its host-protective characteristics. Complement activation products have been associated with the severity of injuries, which sometimes serve as predictors for the onset of organ dysfunctions. Animal studies utilizing complement-targeting agents have provided the basis for considering complement in the management of traumatic injuries in humans. However, numerous studies suggest that the spatial and temporal aspects of complement inhibition are crucial for its efficacy. Understanding the underlying mechanism of the injury is essential to determine where, when, and whether complement inhibition is warranted. Despite the detrimental effects of uncontrolled complement activation, its regulated activation may contribute to essential aspects of healing, such as waste removal and regeneration. This review focuses on the beneficial roles of complement activation in trauma, which are often overlooked or given less consideration but are of immense importance.

Abstract G6b-B is a megakaryocyte lineage-specific immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif (ITIM)-containing receptor, essential for platelet homeostasis. Mice with a genomic deletion of the entire Mpig6b locus develop severe macrothrombocytopenia and myelofibrosis, which is reflected in humans with null-mutations in MPIG6B . The current model proposes that megakaryocytes lacking G6b-B develop normally, while proplatelet release is hampered, but the underlying molecular mechanism remains unclear. Here, we report on a spontaneous recessive single nucleotide mutation in C57BL/6 mice, localized within the intronic region of the Mpig6b locus that abolishes G6b-B expression and reproduces macrothrombocytopenia, myelofibrosis and osteosclerosis. As the mutation is based on a single nucleotide exchange, Mpig6b mut mice represent an ideal model to study the role of G6b-B. Megakaryocytes from these mice were smaller in size, displayed a less developed demarcation membrane system and reduced expression of receptors. RNA sequencing revealed a striking global reduction in the level of megakaryocyte-specific transcripts, in conjunction with decreased protein levels of the transcription factor GATA-1, and impaired thrombopoietin signaling. The reduced number of mature MKs in the bone marrow was corroborated on a newly developed Mpig6b null mouse strain. Our findings highlight an unexpected essential role of G6b-B in the early differentiation within the megakaryocytic lineage.

Abstract Purpose The aim of this study was to investigate the influence of medial meniscus posterior root avulsion (MMPRA) before and after surgical treatment on the biomechanics of the knee joint, including suture repair forces during daily and crutch‐assisted gait movements. Methods MMPRA were investigated in eight human cadaver knee joint specimens by a dynamic knee joint simulator with daily (normal gait, gait with additional rotational movement, standing up, sitting down) and rehabilitation‐associated movements (crutch‐assisted gait with limited flexion range of motion [30°] and 30% [toe‐touch weight‐bearing, TTWB] and 50% of body weight [partial weight‐bearing, PWB]) with simulated physiologic muscle forces. Each specimen was tested in intact, torn and repaired (transtibial suture) state. The biomechanical parameters were: medial mean contact pressure and area, knee joint kinematics, medial displacement of the posterior meniscus horn and loading on the anchoring suture. Results Significant reduction of the contact area due to the avulsion was observed in all movements except for PWB and sitting down. MMPRA repair significantly increased the contact areas during all movements, bringing them to levels statistically indistinguishable from the initial state. MMPRA resulted in a medial displacement up to 12.8 mm (sitting down) and could be reattached with a residual displacement ranging from 0.7 mm (PWB) to 5.7 mm (standing up), all significantly ( p < 0.001) reduced compared to the torn state. The mean peak anchoring suture load increased from TTWB (77 N), PWB (91 N) to normal gait (194 N), gait rotation (207 N), sitting (201 N; p < 0.01) and to standing up (232 N; p = 0.03). Conclusion Surgical treatment of MMPRA allows restoration of physiological knee joint biomechanics. Crutch‐assisted movements reduce the loading of the repair suture, thus likewise the risk for failure. From a biomechanical point of view, crutch‐assisted movements are recommended for the early rehabilitation phase after MMPRA repair. Level of Evidence Level V.