The regulatory approval of Onpattro, a lipid nanoparticle-based short interfering RNA drug for the treatment of polyneuropathies induced by hereditary transthyretin amyloidosis, paves the way for clinical development of many nucleic acid-based therapies enabled by nanoparticle delivery.

Lipid nanoparticles (LNPs) have proven to be highly efficient carriers of short-interfering RNAs (siRNAs) to hepatocytes in vivo; however, the precise mechanism by which this efficient delivery occurs has yet to be elucidated. We found that apolipoprotein E (apoE), which plays a major role in the clearance and hepatocellular uptake of physiological lipoproteins, also acts as an endogenous targeting ligand for ionizable LNPs (iLNPs), but not cationic LNPs (cLNPs). The role of apoE was investigated using both in vitro studies employing recombinant apoE and in vivo studies in wild-type and apoE(-/-) mice. Receptor dependence was explored in vitro and in vivo using low-density lipoprotein receptor (LDLR(-/-))-deficient mice. As an alternative to endogenous apoE-based targeting, we developed a targeting approach using an exogenous ligand containing a multivalent N-acetylgalactosamine (GalNAc)-cluster, which binds with high affinity to the asialoglycoprotein receptor (ASGPR) expressed on hepatocytes. Both apoE-based endogenous and GalNAc-based exogenous targeting appear to be highly effective strategies for the delivery of iLNPs to liver.

Special (lipid) delivery: The role of the ionizable lipid pKa in the in vivo delivery of siRNA by lipid nanoparticles has been studied with a large number of head group modifications to the lipids. A tight correlation between the lipid pKa value and silencing of the mouse FVII gene (FVII ED50) was found, with an optimal pKa range of 6.2–6.5 (see graph). The most potent cationic lipid from this study has ED50 levels around 0.005 mg kg−1 in mice and less than 0.03 mg kg−1 in non-human primates.

Conjugation of small interfering RNA (siRNA) to an asialoglycoprotein receptor ligand derived from N-acetylgalactosamine (GalNAc) facilitates targeted delivery of the siRNA to hepatocytes in vitro and in vivo. The ligands derived from GalNAc are compatible with solid-phase oligonucleotide synthesis and deprotection conditions, with synthesis yields comparable to those of standard oligonucleotides. Subcutaneous (SC) administration of siRNA–GalNAc conjugates resulted in robust RNAi-mediated gene silencing in liver. Refinement of the siRNA chemistry achieved a 5-fold improvement in efficacy over the parent design in vivo with a median effective dose (ED50) of 1 mg/kg following a single dose. This enabled the SC administration of siRNA–GalNAc conjugates at therapeutically relevant doses and, importantly, at dose volumes of ≤1 mL. Chronic weekly dosing resulted in sustained dose-dependent gene silencing for over 9 months with no adverse effects in rodents. The optimally chemically modified siRNA–GalNAc conjugates are hepatotropic and long-acting and have the potential to treat a wide range of diseases involving liver-expressed genes.

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) regulates low density lipoprotein receptor (LDLR) protein levels and function. Loss of PCSK9 increases LDLR levels in liver and reduces plasma LDL cholesterol (LDLc), whereas excess PCSK9 activity decreases liver LDLR levels and increases plasma LDLc. Here, we have developed active, cross-species, small interfering RNAs (siRNAs) capable of targeting murine, rat, nonhuman primate (NHP), and human PCSK9. For in vivo studies, PCSK9 and control siRNAs were formulated in a lipidoid nanoparticle (LNP). Liver-specific siRNA silencing of PCSK9 in mice and rats reduced PCSK9 mRNA levels by 50–70%. The reduction in PCSK9 transcript was associated with up to a 60% reduction in plasma cholesterol concentrations. These effects were shown to be mediated by an RNAi mechanism, using 5′-RACE. In transgenic mice expressing human PCSK9, siRNAs silenced the human PCSK9 transcript by >70% and significantly reduced PCSK9 plasma protein levels. In NHP, a single dose of siRNA targeting PCSK9 resulted in a rapid, durable, and reversible lowering of plasma PCSK9, apolipoprotein B, and LDLc, without measurable effects on either HDL cholesterol (HDLc) or triglycerides (TGs). The effects of PCSK9 silencing lasted for 3 weeks after a single bolus i.v. administration. These results validate PCSK9 targeting with RNAi therapeutics as an approach to specifically lower LDLc, paving the way for the development of PCSK9-lowering agents as a future strategy for treatment of hypercholesterolemia.

In recent years, RNA interference (RNAi) therapeutics, most notably with lipid nanoparticle-based delivery systems, have advanced into human clinical trials. The results from these early clinical trials suggest that lipid nanoparticles (LNPs), and the novel ionizable lipids that comprise them, will be important materials in this emerging field of medicine. A persistent theme in the use of materials for biomedical applications has been the incorporation of biodegradability as a means to improve biocompatibility and/or to facilitate elimination. Therefore, the aim of this work was to further advance the LNP platform through the development of novel, next-generation lipids that combine the excellent potency of the most advanced lipids currently available with biodegradable functionality. As a representative example of this novel class of biodegradable lipids, the lipid evaluated in this work displays rapid elimination from plasma and tissues, substantially improved tolerability in preclinical studies, while maintaining in vivo potency on par with that of the most advanced lipids currently available. In recent years, RNA interference (RNAi) therapeutics, most notably with lipid nanoparticle-based delivery systems, have advanced into human clinical trials. The results from these early clinical trials suggest that lipid nanoparticles (LNPs), and the novel ionizable lipids that comprise them, will be important materials in this emerging field of medicine. A persistent theme in the use of materials for biomedical applications has been the incorporation of biodegradability as a means to improve biocompatibility and/or to facilitate elimination. Therefore, the aim of this work was to further advance the LNP platform through the development of novel, next-generation lipids that combine the excellent potency of the most advanced lipids currently available with biodegradable functionality. As a representative example of this novel class of biodegradable lipids, the lipid evaluated in this work displays rapid elimination from plasma and tissues, substantially improved tolerability in preclinical studies, while maintaining in vivo potency on par with that of the most advanced lipids currently available.

ABSTRACT Adeno-associated virus (AAV)-based gene therapy could be facilitated by the development of molecular switches to control the magnitude and timing of expression of therapeutic transgenes. RNA interference (RNAi)-based approaches hold unique potential as a clinically proven modality to pharmacologically regulate AAV gene dosage in a sequence-specific manner. We present a generalizable RNAi-based rheostat wherein AAV transgene expression is silenced using the clinically validated modality of chemically modified short interfering RNA (siRNA) conjugates or vectorized co-expression of short hairpin RNA (shRNA). For transgene induction, we employ REVERSIR technology, a synthetic high-affinity oligonucleotide complementary to the siRNA or shRNA guide strand to reverse RNAi activity and rapidly recover transgene expression. For potential clinical development, we report potent and specific siRNA sequences that may allow selective regulation of transgenes while minimizing unintended off-target effects. Our results establish a conceptual framework for RNAi-based regulatory switches with potential for infrequent dosing in clinical settings to dynamically modulate expression of virally-delivered gene therapies.

Abstract RNA interference is a natural antiviral mechanism that could be harnessed to combat SARS-CoV-2 infection by targeting and destroying the viral genome. We screened lipophilic small-interfering RNA (siRNA) conjugates targeting highly conserved regions of the SARS-CoV-2 genome and identified leads targeting outside of the spike-encoding region capable of achieving ≥3-log viral reduction. Serial passaging studies demonstrated that a two-siRNA combination prevented development of resistance compared to a single-siRNA approach. A two-siRNA combination delivered intranasally protected Syrian hamsters from weight loss and lung pathology by viral infection upon prophylactic administration but not following onset of infection. Together, the data support potential utility of RNAi as a prophylactic approach to limit SARS-CoV-2 infection that may help combat emergent variants, complement existing interventions, or protect populations where vaccines are less effective. Most importantly, this strategy has implications for developing medicines that may be valuable in protecting against future coronavirus pandemics.