Adaptor protein 180 (AP180) and its homolog, clathrin assembly lymphoid myeloid leukemia protein (CALM), are closely related proteins that play important roles in clathrin-mediated endocytosis. Here, we present the structure of the NH2-terminal domain of CALM bound to phosphatidylinositol-4,5- bisphosphate [PtdIns(4,5)P2] via a lysine-rich motif. This motif is found in other proteins predicted to have domains of similar structure (for example, Huntingtin interacting protein 1). The structure is in part similar to the epsin NH2-terminal (ENTH) domain, but epsin lacks the PtdIns(4,5)P2-binding site. Because AP180 could bind to PtdIns(4,5)P2 and clathrin simultaneously, it may serve to tether clathrin to the membrane. This was shown by using purified components and a budding assay on preformed lipid monolayers. In the presence of AP180, clathrin lattices formed on the monolayer. When AP2 was also present, coated pits were formed.

Multiple essential membrane trafficking pathways converge at endosomes to maintain cellular homeostasis by sorting critical transmembrane cargo proteins to the plasma membrane or the trans-Golgi network (TGN). The Retromer heterotrimer (VPS26/VPS35/VPS29 subunits) binds multiple sorting nexin (SNX) proteins on endosomal membranes, but molecular mechanisms regarding formation and regulation of metazoan SNX/Retromer complexes have been elusive. Here, we combine biochemical and biophysical approaches with AlphaFold2 Multimer modeling to identify a direct interaction between the VARP N-terminus and SNX27 PDZ domain. VARP and SNX27 interact with high nanomolar affinity using the binding pocket established for PDZ binding motif (PDZbm) cargo. Specific point mutations in VARP abrogate the interaction in vitro. We further establish a full biochemical reconstitution system using purified mammalian proteins to directly and systematically test whether multiple endosomal coat complexes are recruited to membranes to generate tubules. We successfully use purified coat components to demonstrate which combinations of Retromer with SNX27, ESCPE-1 (SNX2/SNX6), or both complexes can remodel membranes containing physiological cargo motifs and phospholipid composition. SNX27, alone and with Retromer, induces tubule formation in the presence of PI(3)P and PDZ cargo motifs. ESCPE-1 deforms membranes enriched with Folch I and CI-MPR cargo motifs, but surprisingly does not recruit Retromer. Finally, we find VARP is required to reconstitute a proposed endosomal supercomplex containing SNX27, ESCPE-1, and Retromer on PI(3)P-enriched membranes. These data suggest VARP functions as a key regulator in metazoans to promote cargo sorting out of endosomes.

Abstract TORC1 is a critical controller of cell growth in eukaryotes. In yeast, the presence of nutrients is signaled to TORC1 by several upstream regulatory sensors that together coordinate TORC1 activity. TORC1 localizes to both vacuolar and endosomal membranes, where differential signaling occurs. This localization is mimicked by Pib2, a key upstream TORC1 regulator that is essential for TORC1 reactivation after nutrient starvation or pharmacological inhibition. Pib2 has both positive and negative effects on TORC1 activity, but the mechanisms remain poorly understood. Here, we pinpoint the Pib2 inhibitory function on TORC1 to residues within short, conserved N-terminal regions. We also show that Pib2 C-terminal regions, helical region E and tail, are essential for TORC1 reactivation. Further, the Pib2 FYVE domain is essential for vacuolar localization, however, it is surprisingly unnecessary for recovery from rapamycin exposure. Using chimeric Pib2 targeting constructs, we show that endosomal localization is not necessary for TORC1 reactivation and cell growth after rapamycin treatment. Thus, a comprehensive molecular dissection of Pib2 demonstrates that each of its conserved regions differentially contribute to Pib2 regulation of TORC1 activity.