Abstract Susceptibility to Clostridioides difficile infection (CDI) typically follows the administration of antibiotics. Patients with inflammatory bowel disease (IBD) have increased incidence of CDI, even in the absence of antibiotic treatment. However, the mechanisms underlying this susceptibility are not well understood. To explore the intersection between CDI and IBD, we recently described a mouse model where colitis triggered by the murine gut bacterium, Helicobacter hepaticus, in IL-10 -/- mice led to susceptibility to C. difficile colonization without antibiotic administration. The current work disentangles the relative contributions of inflammation and gut microbiota in colonization resistance to C. difficile in this model. We show that inflammation drives changes in microbiota composition, which leads to CDI susceptibility. Decreasing inflammation with an anti-p40 monoclonal antibody promotes a shift of the microbiota back toward a colonization-resistant state. Transferring microbiota from susceptible and resistant mice to germ-free animals transfers the susceptibility phenotype, supporting the primacy of the microbiota in colonization resistance. These findings shine light on the complex interactions between the host, microbiota, and C. difficile in the context of intestinal inflammation, and may form a basis for the development of strategies to prevent or treat CDI in IBD patients. Importance Patients with inflammatory bowel disease (IBD) have an increased risk of developing C. difficile infection (CDI), even in the absence of antibiotic treatment. Yet, mechanisms regulating C. difficile colonization in IBD patients remain unclear. Here, we use an antibiotic-independent mouse model to demonstrate that intestinal inflammation alters microbiota composition to permit C. difficile colonization in mice with colitis. Notably, treating inflammation with an anti-p40 monoclonal antibody, a clinically relevant IBD therapeutic, restores microbiota-mediated colonization resistance to the pathogen. Through microbiota transfer experiments in germ-free mice, we confirm that the microbiota shaped in the setting of IBD is the primary driver of susceptibility to C. diffiicile colonization. Collectively, our findings provide insight into CDI pathogenesis in the context of intestinal inflammation, which may inform methods to manage infection in IBD patients. More broadly, this work advances our understanding of mechanisms by which the host-microbiota interface modulates colonization resistance to C. difficile .

Abstract The mammalian gut is home to a vibrant community of microbes. As the gut microbiota has evolved, its members have formed a complex yet stable relationships that prevent non-indigenous microorganisms, such as Clostridioides difficile , from establishing within the gut. Using a bioreactor model of the gut, we characterize how variation in microbial community assembly changes its ability to resist C. difficile . We established diluted microbial communities from healthy human stool in a bioreactor gut model and subsequently challenged them with vegetative C. difficile . 16S rRNA-gene sequencing and selective plating revealed that dilution progressively increases microbiota variability and decreases C. difficile colonization resistance. Using Dirichlet Multinomial Mixtures and linear discriminant analysis of effect size, we identified 19 bacterial taxa, including Bifidobacterium, Bacteroides and Lachnospiraceae, that associate with more resistant community types. Since these taxa are associated with butyrate production, which is tied to C. difficile colonization resistance, we performed another reactor experiment where we increased inulin concentrations prior to C. difficile challenge. Diluted communities concurrently lost their ability to produce additional butyrate in response to inulin, as measured by high performance liquid chromatography, and resist C. difficile colonization. These data demonstrate that a similar level of microbiota cohesiveness is required to prevent C. difficile colonization and metabolize inulin. It also suggests that metabolic activity of butyrate-producing microbes is tied to colonization resistance. Future work can leverage these findings to develop treatments that leverage knowledge of these ecological dynamics to improve efficacy. Importance The microbes living in the human large intestine helps create an environment that is resistant to organisms that do not normally reside there, such as the pathogen Clostridioides difficile . Differences in ways in which microbial communities make an environment their home can change their ability to provide that resistance. To study those differences, we use a model of the intestine that incorporates only microbial variables (i.e. no host is involved). By diluting microbial communities to decrease their complexity, we show that communities lose their ability to resist C. difficile at a particular point and, at the same time, their ability to use inulin, a common dietary fiber, in ways that make the environment more toxic to C. difficile . These findings will help future researchers dissect the microbial components that create a resistant intestinal environment.

Abstract Clostridioides difficile, a Gram-positive, spore-forming bacterium, is the primary cause of infectious nosocomial diarrhea. Antibiotics are a major risk factor for C. difficile infection (CDI) as they disrupt the gut microbial community, enabling increased germination of spores and growth of vegetative C. difficile . To date the only single-species bacterial preparation that has demonstrated efficacy in reducing recurrent CDI in humans is non-toxigenic C. difficile. Using multiple infection models we determined that pre-colonization with a less virulent strain is sufficient to protect from challenge with a lethal strain of C. difficile, surprisingly even in the absence of adaptive immunity. Additionally, we showed that protection is dependent on high levels of colonization by the less virulent strain and that it is mediated by exclusion of the invading strain. Our results suggest that reduction of amino acids, specifically glycine following colonization by the first strain of C. difficile is sufficient to decrease germination of the second strain thereby limiting colonization by the lethal strain. Importance Antibiotic-associated colitis is often caused by infection with the bacterium Clostridioides difficile. In this study we found that reduction of the amino acid glycine by pre-colonization with a less virulent strain of C. difficile is sufficient to decrease germination of a second strain. This finding demonstrates that the axis of competition for nutrients can include multiple life stages. This work is important, as it is the first to identify a possible mechanism through which pre-colonization with C. difficile , a current clinical therapy, provides protection from reinfection. Furthermore, our work suggests that targeting nutrients utilized by all life stages could be an improved strategy for bacterial therapeutics that aim to restore colonization resistance in the gut.