Abstract Transient protein-protein interactions are fundamental aspects of many biochemical reactions, but they are technically challenging to study. Chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry (CXMS) analysis is a powerful tool to facilitate the analysis of transient interactions. Central to this technology are chemical cross-linkers. Here, using two transient heterodimeric complexes—EIN/HPr with a K D of 7 μM and EIIA Glc /EIIB Glc with a K D of 25 μM—as model systems, we compared the effects of two amine-specific homo-bifunctional cross-linkers of different cross-linking speeds. Protein cross-linking by DOPA2, a di- ortho -phthalaldehyde cross-linker, is 60-120 times faster than that by DSS, an N-hydroxysuccinimide ester cross-linker. We analyzed the differences in the number of cross-links identified that reflected the stereospecific complex (SC), the final lowest-energy conformational state, and that of cross-links that reflected the encounter complexes (ECs), an ensemble of short-lived intermediate conformations mediated by nonspecific electrostatic interactions. We found that the faster DOPA2 cross-linking favored the SC whereas the slower DSS cross-linking favored the ECs. We propose a mechanistic model for this intriguing observation. This study suggests that it is feasible to probe the dynamics of protein-protein interaction using cross-linkers of different cross-linking speeds.

Abstract Chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis (CXMS) has become a widely used method for protein structure analysis. Central to this technology are chemical cross-linkers. The most popular cross-linkers are N-hydroxysuccinimide (NHS) esters, which react with protein amino groups relatively slowly over 10 minutes or more while in competition with the hydrolysis reaction of NHS esters. To improve the speed of cross-linking, we developed a new class of amine-selective and non-hydrolyzable d i- o rtho - p hthal a ldehyde (DOPA) cross-linkers. DOPA can cross-link proteins in 10 seconds under near physiological conditions, which is 60 times faster than the NHS ester cross-linker DSS. DOPA also works at low pH, low temperature, or in the presence of high concentrations of denaturants such as 8 M urea or 6 M guanidine hydrochloride. Further, DOPA-mediated pulse cross-linking captured the dynamic conformational changes associated with RNase A unfolding. Lastly, DOPA outperformed DSS at capturing weak but specific protein-protein interactions.

In this work, it was found that the presence of nitrilotriacetic acid (NTA) could enhance the elimination of sulfamethoxazole (SMX) significantly in Mn(II)/peracetic acid (PAA) process. NTA firstly complexed with Mn(II) to produce Mn(II)-NTA complex, which could activate PAA producing CH3C(O)O· and Mn(III)-NTA complex. Subsequently, Mn(V) was generated via two-electron transfer between Mn(III)-NTA complex and PAA. According to the results of UV–vis spectrum analysis, scavenging experiments and chemical probe method, organic radicals and Mn(V) were proved to participate in SMX abatement and Mn(V) was the predominant reactive oxidant. Four possible degradation pathways of SMX in Mn(II)/PAA/NTA process including hydroxylation, amino oxidation, bond cleavage and coupling reaction were proposed based on six identified degradation products. Mn(II)/PAA/NTA process worked only in acidic and neutral conditions and the increase in PAA, Mn(II) or NTA concentration could accelerate SMX removal. This study provides a strategy for improving PAA activation by Mn(II) and an insight into SMX degradation mechanism by Mn(II)/PAA/NTA process.