Quercetin is a flavonoid present in many vegetables, fruits, and beverages. Due to its anti-oxidant, anti-tumor, and anti-inflammatory activity, quercetin has been studied extensively as a chemoprevention agent in several cancer models. Since most of these studies used higher doses of quercetin than clinically achievable, we focused on the effectiveness of physiologically relevant doses of quercetin. A low dose of quercetin exerted cancer cell-specific inhibition of proliferation and this inhibition resulted from cell cycle arrest at the G(1) phase. Quercetin induced p21 CDK inhibitor with a concomitant decrease of phosphorylation of pRb, which inhibits the G(1)/S cell cycle progression by trapping E2F1. A low dose of quercetin induced mild DNA damage and Chk2 activation, which is the main regulator of p21 expression by quercetin. In addition, quercetin down-regulated the cyclin B1 and CDK1, essential components of G(2)/M cell cycle progression. Inhibition of the recruitment of key transcription factor NF-Y to cyclin B1 gene promoter by quercetin led to transcriptional inhibition. This study proved that the chemo-preventive efficacy of a physiologically relevant dose of quercetin can be achievable through the inhibition of cell cycle progression.

Significance Whereas the role of the ubiquitin system in protein degradation is well established, little is known regarding the regulation of its own components, including its catalytic arm, the 26S proteasome. Here we show that in stressed mammalian cells, the proteasome is targeted by autophagy, which requires site-specific ubiquitination of its ubiquitin receptors. The process is mediated by the p62/SQSTM1 adapter and requires its ubiquitin-associated domain. Independently, p62 serves also as a shuttling protein for ubiquitinated substrates, using its PB1 domain. This places p62 in a pivotal position where under certain conditions it binds to the proteasome as a protease, whereas in other conditions it recognizes the proteasome as a prey. The regulation of this intricate “decision making” process remains elusive.

Macroautophagy mediates the selective degradation of proteins and non-proteinaceous cellular constituents. Here, we show that the N-end rule pathway modulates macroautophagy. In this mechanism, the autophagic adapter p62/SQSTM1/Sequestosome-1 is an N-recognin that binds type-1 and type-2 N-terminal degrons (N-degrons), including arginine (Nt-Arg). Both types of N-degrons bind its ZZ domain. By employing three-dimensional modeling, we developed synthetic ligands to p62 ZZ domain. The binding of Nt-Arg and synthetic ligands to ZZ domain facilitates disulfide bond-linked aggregation of p62 and p62 interaction with LC3, leading to the delivery of p62 and its cargoes to the autophagosome. Upon binding to its ligand, p62 acts as a modulator of macroautophagy, inducing autophagosome biogenesis. Through these dual functions, cells can activate p62 and induce selective autophagy upon the accumulation of autophagic cargoes. We also propose that p62 mediates the crosstalk between the ubiquitin-proteasome system and autophagy through its binding Nt-Arg and other N-degrons.Soluble misfolded proteins that fail to be degraded by the ubiquitin proteasome system (UPS) are redirected to autophagy via specific adaptors, such as p62. Here the authors show that p62 recognises N-degrons in these proteins, acting as a N-recognin from the proteolytic N-end rule pathway, and targets these cargos to autophagosomal degradation.

Abstract Targeted protein degradation allows targeting undruggable proteins for therapeutic applications as well as eliminating proteins of interest for research purposes. While several degraders that harness the proteasome or the lysosome have been developed, a technology that simultaneously degrades targets and accelerates cellular autophagic flux is still missing. In this study, we develop a general chemical tool and platform technology termed AUTOphagy-TArgeting Chimera (AUTOTAC), which employs bifunctional molecules composed of target-binding ligands linked to autophagy-targeting ligands. AUTOTACs bind the ZZ domain of the otherwise dormant autophagy receptor p62/Sequestosome-1/SQSTM1, which is activated into oligomeric bodies in complex with targets for their sequestration and degradation. We use AUTOTACs to degrade various oncoproteins and degradation-resistant aggregates in neurodegeneration at nanomolar DC 50 values in vitro and in vivo. AUTOTAC provides a platform for selective proteolysis in basic research and drug development.

The arginyl-transferase ATE1 is a tRNA-dependent enzyme that covalently attaches an arginine molecule to a protein substrate. Conserved from yeast to humans, ATE1 deficiency in mice correlates with defects in cardiovascular development and angiogenesis and results in embryonic lethality, while conditional knockouts exhibit reproductive, developmental, and neurological deficiencies. Despite the recent revelation of the tRNA binding mechanism and the catalytic cycle of yeast ATE1, the structure-function relationship of ATE1 in higher organisms is not well understood. In this study, we present the three-dimensional structure of human ATE1 in an apo-state and in complex with its tRNA cofactor and a peptide substrate. In contrast to its yeast counterpart, human ATE1 forms a symmetric homodimer, which dissociates upon binding of a substrate. Furthermore, human ATE1 includes a unique and extended loop that wraps around tRNAArg, creating extensive contacts with the T-arm of the tRNA cofactor. Substituting key residues identified in the substrate binding site of ATE1 abolishes enzymatic activity and results in the accumulation of ATE1 substrates in cells. ATE1 is an essential gene in mammals and is recognized as a master regulator of cells. Here, the authors describe structural insights into human ATE1, revealing mechanisms that regulate arginylation activity in cells.

Abstract The 26S proteasome consists of loosely associated 20S catalytic and 19S regulatory complexes. Approximately half of the proteasomes in eukaryotic cells exist as free 20S complexes; however, our mechanistic and physiological understanding of what determines the ratio of 26S to 20S species remains incomplete. Here, we show that glucose starvation in mammalian cells results in the uncoupling of 26S holoenzymes into intact 20S and 19S subcomplexes. Subcomplex affinity-purification and quantitative mass spectrometry revealed that Ecm29 proteasome adaptor and scaffold (ECPAS) is a crucial mediator of this structural remodeling. The loss of ECPAS abrogated 26S dissociation, leading to decreased degradation of 20S proteasome substrates such as puromycylated polypeptides and lysine-less cyclin B. In silico modeling analysis suggested that the conformational changes of ECPAS may commence the disassembly process. ECPAS was also essential for proper endoplasmic reticulum stress response and cell survival during glucose starvation. In addition, we evaluated the role of ECPAS in vivo using the mouse xenograft model and observed that glucose-deprived tumor tissues had significantly elevated 20S proteasome levels. Collectively, our results indicate that the 20S-19S disassembly mediated by ECPAS is a novel mechanism adapting global proteolysis to physiological needs and an effective cellular strategy against proteotoxic stress.