Here, we use single-molecule techniques to study the aggregation of α-synuclein, the protein whose misfolding and deposition is associated with Parkinson's disease. We identify a conformational change from the initially formed oligomers to stable, more compact proteinase-K-resistant oligomers as the key step that leads ultimately to fibril formation. The oligomers formed as a result of the structural conversion generate much higher levels of oxidative stress in rat primary neurons than do the oligomers formed initially, showing that they are more damaging to cells. The structural conversion is remarkably slow, indicating a high kinetic barrier for the conversion and suggesting that there is a significant period of time for the cellular protective machinery to operate and potentially for therapeutic intervention, prior to the onset of cellular damage. In the absence of added soluble protein, the assembly process is reversed and fibrils disaggregate to form stable oligomers, hence acting as a source of cytotoxic species.

Ischemia is a major cause of brain damage, and patient management is complicated by the paradoxical injury that results from reoxygenation. We have now explored the generation of reactive oxygen species (ROS) in hippocampal and cortical neurons in culture in response to oxygen and glucose deprivation or metabolic inhibition and reoxygenation. Fluorescence microscopy was used to measure the rate of ROS generation using hydroethidine, dicarboxyfluorescein diacetate, or MitoSOX. ROS generation was correlated with changing mitochondrial potential (rhodamine 123), [Ca 2+ ] c (fluo-4, fura-2, or Indo-1), or ATP consumption, indicated by increased [Mg 2+ ] c . We found that three distinct mechanisms contribute to neuronal injury by generating ROS and oxidative stress, each operating at a different stage of ischemia and reperfusion. In response to hypoxia, mitochondria generate an initial burst of ROS, which is curtailed once mitochondria depolarize or prevented by previous depolarization with uncoupler. A second phase of ROS generation that followed after a delay was blocked by the xanthine oxidase (XO) inhibitor oxypurinol. This phase correlated with a rise in [Mg 2+ ] c , suggesting XO activation by accumulating products of ATP consumption. A third phase of ROS generation appeared at reoxygenation. This was blocked by NADPH oxidase inhibitors and was absent in cells from gp91 phox−/− knock-out mice. It was Ca 2+ dependent, suggesting activation by increased [Ca 2+ ] c during anoxia, itself partly attributable to glutamate release. Inhibition of either the NADPH oxidase or XO was significantly neuroprotective. Thus, oxidative stress contributes to cell death over and above the injury attributable to energy deprivation.

Mutations in PINK1 cause autosomal recessive Parkinson's disease.PINK1 is a mitochondrial kinase of unknown function.We investigated calcium homeostasis and mitochondrial function in PINK1deficient mammalian neurons.We demonstrate physiologically that PINK1 regulates calcium efflux from the mitochondria via the mitochondrial Na + /Ca 2+ exchanger.PINK1 deficiency causes mitochondrial accumulation of calcium, resulting in mitochondrial calcium overload.We show that calcium overload stimulates reactive oxygen species (ROS) production via NADPH oxidase.ROS production inhibits the glucose transporter, reducing substrate delivery and causing impaired respiration.We demonstrate that impaired respiration may be restored by provision of mitochondrial complex I and II substrates.Taken together, reduced mitochondrial calcium capacity and increased ROS lower the threshold of opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) such that physiological calcium stimuli become sufficient to induce mPTP opening in PINK1-deficient cells.Our findings propose a mechanism by which PINK1 dysfunction renders neurons vulnerable to cell death.

β-Amyloid (βA) peptide is strongly implicated in the neurodegeneration underlying Alzheimer's disease, but the mechanisms of neurotoxicity remain controversial. This study establishes a central role for oxidative stress by the activation of NADPH oxidase in astrocytes as the cause of βA-induced neuronal death. βA causes a loss of mitochondrial potential in astrocytes but not in neurons. The mitochondrial response consists of Ca 2+ -dependent transient depolarizations superimposed on a slow collapse of potential. The slow response is both prevented by antioxidants and, remarkably, reversed by provision of glutamate and other mitochondrial substrates to complexes I and II. These findings suggest that the depolarization reflects oxidative damage to metabolic pathways upstream of mitochondrial respiration. Inhibition of NADPH oxidase by diphenylene iodonium or 4-hydroxy-3-methoxy-acetophenone blocks βA-induced reactive oxygen species generation, prevents the mitochondrial depolarization, prevents βA-induced glutathione depletion in both neurons and astrocytes, and protects neurons from cell death, placing the astrocyte NADPH oxidase as a primary target of βA-induced neurodegeneration.

Nuclear factor (erythroid-derived 2) factor 2 (Nrf2) is a crucial transcription factor mediating protection against oxidants. Nrf2 is negatively regulated by cytoplasmic Kelch-like ECH associated protein 1 (Keap1) thereby providing inducible antioxidant defence. Antioxidant properties of Nrf2 are thought to be mainly exerted by stimulating transcription of antioxidant proteins, whereas its effects on ROS production within the cell are uncertain.Live cell imaging and qPCR in brain hippocampal glio-neuronal cultures and explants slice cultures with graded expression of Nrf2, i.e. Nrf2-knockout (Nrf2-KO), wild-type (WT), and Keap1-knockdown (Keap1-KD).We here show that ROS production in Nrf2-KO cells and tissues is increased compared to their WT counterparts. Mitochondrial ROS production is regulated by the Keap1-Nrf2 pathway by controlling mitochondrial bioenergetics. Surprisingly, Keap1-KD cells and tissues also showed higher rates of ROS production when compared to WT, although with a smaller magnitude. Analysis of the mRNA expression levels of the two NOX isoforms implicated in brain pathology showed, that NOX2 is dramatically upregulated under conditions of Nrf2 deficiency, whereas NOX4 is upregulated when Nrf2 is constitutively activated (Keap1-KD) to a degree which paralleled the increases in ROS production.These observations suggest that the Keap1-Nrf2 pathway regulates both mitochondrial and cytosolic ROS production through NADPH oxidase.Findings supports a key role of the Keap1-Nrf2 pathway in redox homeostasis within the cell.

The negative impact of obesity on reproductive success is well documented but the stages at which development of the conceptus is compromised and the mechanisms responsible for the developmental failure still remain unclear. Recent findings suggest that mitochondria may be a contributing factor. However to date no studies have directly addressed the consequences of maternal obesity on mitochondria in early embryogenesis. Using an established murine model of maternal diet induced obesity and a live cell dynamic fluorescence imaging techniques coupled with molecular biology we have investigated the underlying mechanisms of obesity-induced reduced fertility. Our study is the first to show that maternal obesity prior to conception is associated with altered mitochondria in mouse oocytes and zygotes. Specifically, maternal diet-induced obesity in mice led to an increase in mitochondrial potential, mitochondrial DNA content and biogenesis. Generation of reactive oxygen species (ROS) was raised while glutathione was depleted and the redox state became more oxidised, suggestive of oxidative stress. These altered mitochondrial properties were associated with significant developmental impairment as shown by the increased number of obese mothers who failed to support blastocyst formation compared to lean dams. We propose that compromised oocyte and early embryo mitochondrial metabolism, resulting from excessive nutrient exposure prior to and during conception, may underlie poor reproductive outcomes frequently reported in obese women.

Mutations in PTEN-induced kinase 1 (PINK1) cause early onset autosomal recessive Parkinson's disease (PD). PINK1 is a 63 kDa protein kinase, which exerts a neuroprotective function and is known to localize to mitochondria. Upon entry into the organelle, PINK1 is cleaved to produce a ∼53 kDa protein (ΔN-PINK1). In this paper, we show that PINK1 is cleaved between amino acids Ala-103 and Phe-104 to generate ΔN-PINK1. We demonstrate that a reduced ability to cleave PINK1, and the consequent accumulation of full-length protein, results in mitochondrial abnormalities reminiscent of those observed in PINK1 knockout cells, including disruption of the mitochondrial network and a reduction in mitochondrial mass. Notably, we assessed three N-terminal PD-associated PINK1 mutations located close to the cleavage site and, while these do not prevent PINK1 cleavage, they alter the ratio of full-length to ΔN-PINK1 protein in cells, resulting in an altered mitochondrial phenotype. Finally, we show that PINK1 interacts with the mitochondrial protease presenilin-associated rhomboid-like protein (PARL) and that loss of PARL results in aberrant PINK1 cleavage in mammalian cells. These combined results suggest that PINK1 cleavage is important for basal mitochondrial health and that PARL cleaves PINK1 to produce the ΔN-PINK1 fragment.

Significance Certain oligomeric species generated during the self-assembly of specific proteins into ordered fibrillar aggregates are likely to be key players in the initiation and spreading of neurodegenerative diseases. We have purified stable toxic oligomeric species of α-synuclein and defined and minimized their degree of heterogeneity, which has allowed us to identify distinct subgroups of oligomers and determine their structural properties and three-dimensional molecular architectures. All the oligomeric subgroups possess approximately cylindrical architectures with marked similarities to amyloid fibrils, suggesting that these types of oligomers are kinetically trapped during protein self-assembly. The relative stabilities and inherent pathological roles of different amyloid oligomers are likely to result from the multiplicity of pathways of the misfolding process and the remarkably slow rates of structural conversions.

Protein aggregation causes α-synuclein to switch from its physiological role to a pathological toxic gain of function. Under physiological conditions, monomeric α-synuclein improves ATP synthase efficiency. Here, we report that aggregation of monomers generates beta sheet-rich oligomers that localise to the mitochondria in close proximity to several mitochondrial proteins including ATP synthase. Oligomeric α-synuclein impairs complex I-dependent respiration. Oligomers induce selective oxidation of the ATP synthase beta subunit and mitochondrial lipid peroxidation. These oxidation events increase the probability of permeability transition pore (PTP) opening, triggering mitochondrial swelling, and ultimately cell death. Notably, inhibition of oligomer-induced oxidation prevents the pathological induction of PTP. Inducible pluripotent stem cells (iPSC)-derived neurons bearing SNCA triplication, generate α-synuclein aggregates that interact with the ATP synthase and induce PTP opening, leading to neuronal death. This study shows how the transition of α-synuclein from its monomeric to oligomeric structure alters its functional consequences in Parkinson's disease.

Summary Transcription factor Nrf2 and its repressor Keap1 regulate a network of cytoprotective genes involving more than 1% of the genome, their best known targets being drug-metabolizing and antioxidant genes. Here we demonstrate a novel role for this pathway in directly regulating mitochondrial bioenergetics in murine neurons and embryonic fibroblasts. Loss of Nrf2 leads to mitochondrial depolarisation, decreased ATP levels and impaired respiration, whereas genetic activation of Nrf2 increases the mitochondrial membrane potential and ATP levels, the rate of respiration and the efficiency of oxidative phosphorylation. We further show that Nrf2-deficient cells have increased production of ATP in glycolysis, which is then used by the F1Fo-ATPase for maintenance of the mitochondrial membrane potential. While the levels and in vitro activities of the respiratory complexes are unaffected by Nrf2 deletion, their activities in isolated mitochondria and intact live cells are substantially impaired. In addition, the rate of regeneration of NADH after inhibition of respiration is much slower in Nrf2-knockout cells than in their wild-type counterparts. Taken together, these results show that Nrf2 directly regulates cellular energy metabolism through modulating the availability of substrates for mitochondrial respiration. Our findings highlight the importance of efficient energy metabolism in Nrf2-mediated cytoprotection.