The diabetes mellitus (DM) induces several changes, with substantial increase of reactive oxygen species (ROS). The ROS cause damage to systemic and renal microvasculature, which could be one of the mechanisms involved in the development of diabetic nephropathy (DN). The ROS modulate other substances like the nitric oxide (NO), a vasodilator with important role in the renal function. N-acetylcysteine (NAC) is an antioxidant that acts replenishing intracellular cysteine levels, which is essential for glutathione formation. The aim of this study was to evaluate the effect of early or late NAC treatment on oxidative/nitrosative stress in DN progression. All rats were submitted to unilateral nephrectomy and diabetes was induced with streptozotocin. The animals were allocated into six groups: controls that received water (CTL) or NAC (CTL + NAC); diabetic groups that received early or late, water (DM-E; DM-L) or NAC (DM + NAC-E; DM + NAC-L), started on 5th day (early) or 4th week (late) after diabetes induction, during 8 weeks. After NAC treatment, the rats were placed in individual metabolic cages to obtain urine and blood samples for analysis of metabolic profile, renal function, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and NO. At the end of the protocol, the renal cortex was removed for TBARS, NOS evaluation, antioxidants markers and histology. The DM-E group compared to CTL showed a significant increase in glycemia and proteinuria and impaired renal function; there was a significant increase of TBARS in plasma, urine and renal tissue, and also a significant decrease in plasma NO, which were reverted after early NAC treatment. The eNOS was decreased and iNOS was increased in DM-E vs. CTL, p < 0.05. The early NAC treatment in DM rats reduced proteinuria, creatinine, urea, TBARS and iNOS and, increased creatinine clearance, NO and eNOS, increasing significantly the antioxidant defenses, promoting elevated catalase and glutathione compared to DM-E group, all p < 0.05. The late NAC treatment in diabetic rats vs.DM-E showed reduced proteinuria and TBARS excretion and higher values of creatinine clearance and NO, all statistically significant. Histological analysis of the animals in DM-E or DM-L showed significant tubular changes with degeneration and vacuolization in tubular cells, dilated tubular lumen, intense glycosidic degeneration, and discreet mesangial expansion with interstitial fibrosis area. The DM + NAC-E group showed moderate glycosidic degeneration, however, did not present tubular degeneration or fibrosis. The DM + NAC-L group showed severe glycosidic degeneration, moderate tubular cell degeneration, light and focal dilatation of the tubules, with no fibrosis. Our study showed that NAC protected the diabetic rats against renal injury, probably due to the control of oxidative stress via recovery of the NO bioavailability, showing that early NAC was more effective than late treatment. All these data suggest that NAC may be useful in the adjuvant treatment in a safe way, in the early phase of the disease. Eventually, prolonged treatment, even if it is started later, could change the natural history of the disease, delaying the complications of diabetes in renal tissue.

Background & aims We have previously reported an increased nitrosative stress in the kidneys of diabetic animals, which was reduced by an antioxidant probiotic. The present study evaluated whether the extract of cupuaçu (EC), an antioxidant compound rich in polyphenols and theograndins, when administered at a dose that can be reasonably obtained through daily consumption, could delay the onset of diabetic complications in the kidney. Methods Mouse immortalized mesangial cells (MiMC) were placed in medium normal glucose (NG) or high glucose (HG), with or without EC (500, 100, 50 or 10 μg/mL) during 24, 48 or 72 h for analysis of viability, proliferation, nitric oxide (NO) levels and reactive oxygen species or nitrogen (ROS/RNS). Male, adult Wistar rats were distributed in 4 groups: control (CTL) and diabetic (DM) who received water; CTLEC and DMEC who received 1 mL/day of EC (1 g/mL), via gavage for 8 consecutive weeks. After, metabolic profile and renal function were evaluated and, kidneys were collected for analysis of NO, ROS, 3-nitrotyrosine (3-NT), endothelial nitric oxide synthase (eNOS), IL-6, IL-10, TNF-α and NF-κB p65. Results The MiMC showed normal viability in all groups, demonstrating that EC had no cytotoxic effect at doses on 24, 48 or 72 h. MiMC under HG presented significant increase in proliferation, NO and ROS vs. NG; these parameters were significantly reduced after 72 h of EC treatment (P < 0.05). DMEC showed a significant reduction of feed intake, ROS and NO, 3-NT, IL-6 and eNOS vs. DM (P < 0.05). Supplementation with EC at a dose consumed daily could improve control of nitrosative stress, combined with reduction of inflammatory factors, suggesting the importance of bioactive compounds as non-pharmacological adjuvant therapy to delay kidney complications in diabetic patients.

To evaluate the effects of esculin treatment on P2X7 receptor and mitochondrial dysfunction in the renal cortex of diabetic rats.Male Wistar rats, 7 weeks old, were unilaterally nephrectomized. Part of these animals were induced to diabetes using streptozotocin (60 mg/kg). Diabetes was confirmed 48 h after induction, with blood glucose levels ≥200 mg/dL. Part of control and diabetic animals were selected to receive daily doses of esculin (50 mg/kg), during 8 weeks. The animals were placed in metabolic cages at the eighth week of protocol for 24 h urine collection and a small aliquot of blood was collected for biochemical analysis. After this procedure, the animals were euthanized and the remaining kidney was stored for histopathological analysis, Western blotting and mitochondrial high-resolution respirometry.Although esculin did not change metabolic parameters, renal biochemical function, neither TBARS in DM rats, esculin reduced P2X7 levels in these animals and restored mitochondrial function via glycolysis substrates and β-oxidation. Besides, at the histological analysis, we observed that esculin reduced inflammatory infiltrates and collagen IV deposits as compared to diabetic group.Esculin attenuated the development of renal injuries caused by hyperglycemia, proinflammatory and oxidative mechanisms mediated by P2X7 receptor, as seen by histological findings and improved mitochondrial function in diabetic animals. This suggests that esculin could be used as an adjuvant therapy to prevent the diabetic nephropathy.

The aim was to analize whether Kefir activates nuclear erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) under hyperglycaemic conditions in the kidneys of diabetic rats (DM). DM received kefir for 8 weeks (DMK group). There was a significant reduction in water and chow intake, reduction in diuresis and glycaemia in DMK versus DM, the protein levels of catalase (CAT), superoxide dismutase-1 (SOD-1) and Nrf2 were significantly increased and 3-nitrotyrosine (3-NT) was significantly reduced. Glycaemia had a moderate correlation with NO or superoxide anion and a strong correlation with 3-NT. Kefir improved the metabolic profile, reducing blood glucose and increasing the concentration of Nrf2, modulating CAT and SOD-1 in the renal cortex of diabetic animals, thus contributing to reduced oxidative/nitrosative stress in these animals. These data suggest that kefir could be used as an additional therapy to improve glycaemic control and restore antioxidant defence in the progression of diabetic nephropathy.

To evaluate the effects of P2X7 receptor blockade on renin-angiotensin system (RAS) in rats with diabetic nephropathy (DN).Wistar rats were unilaterally nephrectomized and received streptozotocin for diabetes mellitus (DM) induction; control animals (CTL) received the drug vehicle. The animals were submitted to P2X7 receptor silencing, forming the group (DM + siRNA). The animals were placed in metabolic cages for data collection and evaluation of renal function; at the end of the protocol, the kidney was removed for analysis of P2X7, renin, angiotensin-converting enzyme (ACE), ACE2, angiotensin, thiobarbituric acid reactive substance levels (TBARS), nitric oxide (NO) and qualitative histological.The metabolic profile was attenuated in DM + siRNA vs. DM and there was a significant improvement in creatinine, urea and proteinuria levels in the same group. Renin expression was significantly decreased in DM + siRNA vs. DM. ACE and ACE2 were significantly reduced in DM + siRNA vs. DM. TBARS levels were decreased and NO showed an increase in DM + siRNA vs. DM, both significant. All histological alterations were improved in DM + siRNA vs. DM.Data have shown that although silencing of the P2X7 receptor did not decrease fasting glucose, it promoted an improvement in the metabolic profile and a significant recovery of renal function, revealing a protective action by the inhibition of this receptor. This effect must have occurred due to the inhibition of RAS and the increase of NO, suggesting that the use of P2X7 receptors inhibitors could be used as adjuvant therapy against DN progression.

Previous studies in our laboratory have suggested that P2X7 could contribute to the progression of diabetic nephropathy and modulated klotho expression. The aim of this study was to investigate if P2X7 receptor is related to the expression of klotho in the onset of diabetic nephropathy in rats. Seven-week-old male Wistar rats weighing 210 g were all uninephrectomized; two-third of the animals were induced to diabetes with 60 mg/kg streptozotocin i.v., and one-third received its vehicle (control rats). At 4th day of the fifth week of the protocol, half of the diabetic rats received a small interfering RNA targeting for P2X7 mRNA, and the other half received its vehicle. Euthanasia was made at the eighth week. Diabetic animals reproduced all classic symptoms of the disease; besides, they showed reduced renal function and low NO bioavailability; also, SOD1, SOD2, and catalase were increased, probably due to the oxidative stress which was elevated in this situation. Metabolic data of diabetic rats did not change by silencing P2X7 receptor. For the other hand, silencing P2X7 was able to contribute to balance oxidative and nitrosative profile, ultimately improving the renal function and increasing plasma and membrane forms of klotho. These findings suggest that the management of P2X7 receptor can benefit the kidneys with diabetic nephropathy. Further studies are needed to show the therapeutic potential of this receptor inhibition to provide a better quality of life for the diabetic patient.

Diabetes is characterized by increased levels of oxidative stress. Its suggested that extract of cupuaçu could improve the antioxidant system in diabetes. The aim was to evaluate the effect of EC on Nrf2/NF-κB p65 in normal and diabetic rats. Male, adult Wistar rats (9-week-old) were distributed in 4 groups: control (CTL) and diabetic (DM) who received water; CTLEC and DMEC who received 1 mL/day of EC (1 g/mL), via gavage for 8 consecutive weeks. The diabetes was inducted with a single intravenous dose of 45 mg/kg streptozotocin. Glycemia and body weight were measured at the beginning and end of the protocol, and the renal tissue was analyzed by Western blot for SOD-1, SOD-2, CAT, GSSG, Nrf2, NF-κB p65, iNOS and 3-NT. Glycemia was reduced in DMEC vs. DM after 8 weeks of EC treatment. There was no difference in body weight of DMEC vs. DM; however, DMEC vs. DM presented increased levels of CAT and Nrf2, with a significant reduction of NF-κB p65, iNOS and 3-NT. Therefore, we suggest that EC could be utilized as a complementary therapy to ameliorate the antioxidant profile via Nrf2 and to delay the evolution of diabetic complications in renal tissue by inflammatory pathway inhibition.

Diabetes mellitus is a chronic disease, which progresses with many complications such as the diabetic nephropathy (DN). P2X7 receptor is expressed in pathological conditions, in response to high concentrations of extracellular ATP, as seen in hyperglycemia. When constantly activated, P2X7 can induce inflammatory responses, leading to oxidative stress (OS) and triggering toxic biochemical processes. Coumarin derivatives, such as esculin, are mainly antioxidants but their pharmacodynamics are not yet fully understood. The aim of this study is to evaluate the effects of esculin on P2X7 expression in the kidneys of diabetic rats. In male Wistar rats 7 weeks old, diabetes was induced by a single dose of streptozotocin (60 mg/kg; i.v.); CTL group received only the vehicle. Diabetes was considered in animals with fasting glycaemia greater than 200 mg/dL, 48 hours after induction. Then, the animals received daily doses of esculin (50 mg/kg, p.o.) forming CTL+ESC and DM+ESC groups. 24-hours urine and a small aliquot of blood via retro-orbital plexus were collected for biochemical analysis. The animals were euthanized under anesthesia, at the end of the eighth week of protocol and the kidneys were collected for Western blotting analysis, using antibodies against P2X7. The results are described as mean ± SEM; significance for p<0.05. The protein content of P2X7 was significantly decreased in the renal cortex of diabetic animals that received esculin when compared to untreated diabetic animals (0.76±0.11 vs 1.33±0.21). These animals also presented lower proteinuria (38.72±4.82 vs 45.42±3.0) and urinary TBARS excretion (232.3±28.83 vs 282.0±7.2), both p<0.05 compared with untreated diabetic animals. Our data suggest that esculin treatment decreases the P2X7 receptor in diabetic animals, accompanied by reduced OS and proteinuria, an early marker of DN, pointing to a new treatment that can be applied to control the evolution of this disease.

Diabetes mellitus (DM) is a chronic disease characterized by hyperglycemia that leads to diabetic nephropathy (DN). We showed that P2X7, a purinergic receptor, was highly expressed in DM; however, when oxidative stress was controlled, renal NO recovered, and the activation of this receptor remained significantly reduced. The aim of this study was to assess the influence of NO on the P2X7 and apoptosis in mouse immortalized mesangial cells (MiMC) cultured in high glucose (HG) medium.MiMCs were cultured with DMEM and exposed to normal glucose (NG), mannitol (MA), or HG. Cell viability was assessed by an automated counter. Supernatants were collected for NO quantification, and proteins were extracted for analysis of NO synthases (iNOS and eNOS), caspase-3, and P2X7.Cell viability remained above 90% in all groups. There was a significant increase in the proliferation of cells in HG compared to MA and NG. NO, iNOS, caspase-3, and P2X7 were significantly increased in HG compared to NG and MA, with no changes in eNOS. We observed that there was a strong and significant correlation between P2X7 and NO.The main finding was that the production of NO by iNOS was positively correlated with the increase of P2X7 in MCs under HG conditions, showing that there is a common stimulus between them and that NO interacts with the P2X7 pathway, contributing to apoptosis in experimental DM. These findings could be relevant to studies of therapeutic targets for the prevention and/or treatment of hyperglycemia-induced kidney damage to delay DN progression.