Summary The trace metal manganese in excess affects iron-sulfur cluster and heme-protein biogenesis eliciting cellular toxicity. The manganese efflux protein MntP is crucial to evading manganese toxicity in bacteria. Recently, two Mn-sensing riboswitches upstream of mntP and alx in Escherichia coli have been reported to mediate the upregulation of their expression under manganese shock. As the alx -riboswitch is also responsive to alkaline shock administered externally, it is intriguing whether mntP -riboswitch is also responsive to alkaline stress. Furthermore, how both manganese and alkaline pH simultaneously regulate these two riboswitches under physiological conditions is a puzzle. Using multiple approaches, we show that manganese shock activated glutamine synthetase (GlnA) and glutaminases (GlsA and GlsB) to spike ammonia production in E. coli . The elevated ammonia intrinsically alkalizes the cytoplasm. We establish that this alkalization under manganese stress is crucial for attaining the highest degree of riboswitch activation. Additional studies showed that alkaline pH promotes a 17 to 22-fold tighter interaction between manganese and the mntP -riboswitch element. Our study uncovers a physiological linkage between manganese efflux and pH homeostasis that mediates enhanced manganese tolerance. Significance statement Riboswitch RNAs are cis-acting elements that can adopt alternative conformations in the presence or absence of a specific ligand(s) to modulate transcription termination or translation initiation processes. In the present work, we show that how manganese and alkaline pH both are necessary for maximal mntP -riboswitch activation to mitigate the manganese toxicity. This study bridges the gap between earlier studies that separately emphasize the importance of alkaline pH and manganese in activating the riboswitches belonging to the yybP-ykoY -family. This study also ascribes a physiological relevance as to how manganese can rewire cellular physiology to render cytoplasmic pH alkaline for its homeostasis.

Abstract Spermidine and other polyamines alleviate oxidative stress, yet excess spermidine seems toxic to Escherichia coli unless it is neutralized by SpeG, an enzyme for the spermidine N-acetyl transferase function. Besides, a specific mechanism of SpeG function conferring pathogenic fitness to Staphylococcus aureus USA300 strain is unknown. Here, we provide evidence that although spermidine mitigates oxidative stress by lowering hydroxyl radical and hydrogen peroxide levels, excess of it simultaneously triggers the production of superoxide radicals, thereby causing toxicity in the E. coli Δ speG strain as well as naturally SpeG- deficient S. aureus RN4220 strain. However, wild-type E. coli and S. aureus USA300 with a horizontally-acquired speG gene tolerate applied exogenous spermidine stress. Furthermore, we demonstrate that while RNA-bound spermidine inhibits iron oxidation, free spermidine interacts and oxidizes the iron to evoke superoxide radicals directly. Superoxide radicals thus generated, further affects redox balance and iron homeostasis. Since iron acquisition and metabolism in the host tissues is a challenging task for S. aureus , the current findings helped us explain that the evolutionary gain of SpeG function by S. aureus USA300 strain allows it to neutralize exogenous spermidine- and spermine-mediated toxicity towards iron metabolism inside the host tissues.