Abstract Prokaryotic Argonaute proteins (pAgos) are homologs of eukaryotic Argonautes (eAgos) that were similarly proposed to play a role in cell defense against invaders. However, pAgos are much more diverse than eAgos and very little is known about their functional activity and target specificity in vivo . Here, we describe five pAgo proteins from mesophilic bacteria that act as DNA-guided DNA endonucleases and analyze their ability to target chromosomal and invader DNA. In vitro , the analyzed proteins use small guide DNAs for precise cleavage of single-stranded DNA at a wide range of temperatures. Upon their expression in Escherichia coli , all five pAgos are loaded with small DNAs preferentially produced from plasmid DNA and from chromosomal regions of replication termination. One of the tested pAgos, EmaAgo from Exiguobacterium marinum can induce DNA interference between multicopy sequences resulting in targeted processing of homologous plasmid and chromosomal loci. EmaAgo also protects bacteria from bacteriophage infection and is preferentially loaded with phage guide DNAs suggesting that the ability of pAgos to target multicopy elements may be crucial for their protective function. The wide spectrum of pAgo activities suggests that they may have diverse functions in vivo and paves the way for their use in biotechnology.

ABSTRACT Argonaute proteins are programmable nucleases that are found in both eukaryotes and prokaryotes and provide defense against invading genetic elements. Although some prokaryotic Argonautes (pAgos) were shown to recognize RNA targets in vitro , the majority of studied pAgos have strict specificity toward DNA, which limits their practical use in RNA-centric applications. Here, we describe a unique KmAgo nuclease from the mesophilic bacterium Kurthia massiliensis that can be programmed with either DNA or RNA guides and can precisely cleave both DNA and RNA targets. KmAgo preferentially binds 16-20 nt long 5′-phosphorylated guide molecules with no strict specificity for their sequence and is active in a wide range of temperatures. In bacterial cells, KmAgo is loaded with small DNAs with no obvious sequence preferences suggesting that it can uniformly target genomic sequences. Target cleavage by KmAgo depends on the formation of secondary structure indicating that KmAgo can be used for structural probing of RNA targets. Mismatches between the guide and target sequences greatly affect the efficiency and precision of target cleavage, depending on the mismatch position and the nature of the reacting nucleic acid. These properties of KmAgo open the way for its use for highly specific nucleic acid detection and cleavage.