3D tumoroids have revolutionized in vitro/ex vivo cancer biology by recapitulating the complex diversity of tumors. While tumoroids provide new insights into cancer development and treatment response, several limitations remain. As the tumor microenvironment, especially the immune system, strongly influences tumor development, the absence of immune cells in tumoroids may lead to inappropriate conclusions. Macrophages, key players in tumor progression, are particularly challenging to integrate into the tumoroids. In this study, we established three optimized and standardized methods for co-culturing human macrophages with breast cancer tumoroids: a semi-liquid model and two matrix-embedded models tailored for specific applications. We then tracked interactions and macrophage infiltration in these systems using flow cytometry and light sheet microscopy and showed that macrophages influenced not only tumoroid molecular profiles but also chemotherapy response. This underscores the importance of increasing the complexity of 3D models to more accurately reflect in vivo conditions.

Abstract Breast cancer is the most frequent cancer among women causing the greatest number of cancer-related deaths. Cancer heterogeneity is a main obstacle to therapies. Around 96% of the drugs fail from discovery to the clinical trial phase probably because of the current unreliable preclinical models. New models emerge such as companion dogs who develop spontaneous mammary tumors resembling human breast cancer in many clinical and molecular aspects. The present work aimed at developing a robust canine mammary tumor model in the form of tumoroids which recapitulate the tumor diversity and heterogeneity. We conducted a complete characterization of these canine mammary tumoroids through histologic, molecular and proteomic analysis, demonstrating their strong similarity to the primary tumor. We demonstrated that these tumoroids can be used as a drug screening model. In fact, we showed that Paclitaxel, a human chemotherapeutic, could killed canine tumoroids with the same efficacy as human tumoroids with 0.1 to 1 μM of drug needed to kill 50% of the cells. Due to easy tissue availability, canine tumoroids can be produced at larger scale and cryopreserved to constitute a biobank. We have demonstrated that cryopreserved tumoroids keep the same histologic and molecular features (ER, PR and HER2 expression) as fresh tumoroids. Two techniques of cryopreservation were compared demonstrating that tumoroids made from frozen tumor material allowed to maintain a higher molecular diversity. These findings revealed that canine mammary tumoroids can be easily generated at large scale and can represent a more reliable preclinical model to investigate tumorigenesis mechanisms and develop new treatments for both veterinary and human medicine.

Abstract Chimeric antigen receptor (CAR)-T-cell therapy has revolutionized cellular immunotherapy, demonstrating remarkable efficacy in hematological cancers. However, its application in solid tumors faces significant challenges, including limited T-cell infiltration and tumor-induced immunosuppression. Given the prominent role of macrophages in the tumor microenvironment, their phenotypic plasticity and inherent antitumor properties, such as phagocytosis, offer a promising avenue for therapeutic intervention. This study focuses on the development of a second generation of CAR macrophages (CAR-Ms). We elucidated the role of the proprotein convertase furin in macrophages, demonstrating its overexpression in the presence of tumor cells. Importantly, furin inhibition maintains a proinflammatory macrophage phenotype, potentially redirecting them towards an antitumor state. Compared to furin-expressing counterparts, furin-inhibited CAR-Ms exhibited heightened antitumor phagocytic activity against breast cancer cells and ex vivo patient-derived tumoroids. Notably, they sustained a persistent proinflammatory profile, indicative of enhanced tumoricidal potential. Additionally, furin-inhibited CAR-Ms secreted factors that promote T-cell activation, offering a means to modulate the tumor microenvironment. In summary, our work highlights the translational potential of furin-inhibited CAR-Ms as a potent cellular therapy to mitigate macrophage exhaustion within the tumor environment. By capitalizing on macrophage-mediated antitumor responses, these findings pave the way for the development of second-generation CAR-M therapeutic strategies tailored for solid tumors.