Cys-loop receptors are vital for controlling neuronal excitability in the brain and their dysfunction results in numerous neurological disorders. Recently, six de novo missense variants in GABRA2 gene, a member of this family, have been associated with early infantile epileptic encephalopathy (EIEE) and intellectual disability with seizures. Here, using whole-genome sequencing we identified a de novo missense variant in GABRA2 gene in a patient with EIEE and developmental delay. We perform protein structural analysis of the seven variants and show that all the mutations are in the transmembrane domain, either close to the desensitization gate, the activation gate or in inter-subunit interfaces. Further investigations demonstrated that the majority of pathogenic variants reported are at equivalent positions in other Cys-loop receptors, emphasizing the importance of these residues for the adequate function of the receptor. Also, a comparison of the distribution of the mutations in all the Cys-loop receptors showed that pathogenic variants are more common in the transmembrane helices, more specifically in the M2 helix, highlighting the importance of this segment. Our study expands the clinical spectrum of individuals with pathogenic missense mutations in GABRA2 , defines the regions where pathogenic mutations are in the protein structure, and highlights the value of considering sequence, evolutionary, and structural information from other Cys-loop receptors as a strategy for variant interpretation of novel missense mutations in GABRA2 .

ABSTRACT Constrained Coding Regions (CCRs) in the human genome have been derived from DNA sequencing data of large cohorts of healthy control populations, available in the Genome Aggregation Database (gnomAD) [1]. They identify regions depleted of protein-changing variants and thus identify segments of the genome that have been constrained during human evolution. By mapping these DNA-defined regions from genomic coordinates onto the corresponding protein positions and combining this information with protein annotations, we have explored the distribution of CCRs and compared their co-occurrence with different protein functional features, previously annotated at the amino acid level in public databases. As expected, our results reveal that functional amino acids involved in interactions with DNA/RNA, protein-protein contacts and catalytic sites are the protein features most likely to be highly constrained for variation in the control population. More surprisingly, we also found that linear motifs, linear interacting peptides (LIPs), disorder-order transitions upon binding with other protein partners and liquid-liquid phase separating (LLPS) regions are also strongly associated with high constraint for variability. We also compared intra-species constraints in the human CCRs with inter-species conservation and functional residues to explore how such CCRs may contribute to the analysis of protein variants. As has been previously observed, CCRs are only weakly correlated with conservation, suggesting that intraspecies constraints complement interspecies conservation and can provide more information to interpret variant effects.