Antigen-presenting, major histocompatibility complex (MHC) class II-rich dendritic cells are known to arise from bone marrow. However, marrow lacks mature dendritic cells, and substantial numbers of proliferating less-mature cells have yet to be identified. The methodology for inducing dendritic cell growth that was recently described for mouse blood now has been modified to MHC class II-negative precursors in marrow. A key step is to remove the majority of nonadherent, newly formed granulocytes by gentle washes during the first 2-4 d of culture. This leaves behind proliferating clusters that are loosely attached to a more firmly adherent "stroma." At days 4-6 the clusters can be dislodged, isolated by 1-g sedimentation, and upon reculture, large numbers of dendritic cells are released. The latter are readily identified on the basis of their distinct cell shape, ultrastructure, and repertoire of antigens, as detected with a panel of monoclonal antibodies. The dendritic cells express high levels of MHC class II products and act as powerful accessory cells for initiating the mixed leukocyte reaction. Neither the clusters nor mature dendritic cells are generated if macrophage colony-stimulating factor rather than granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is applied. Therefore, GM-CSF generates all three lineages of myeloid cells (granulocytes, macrophages, and dendritic cells). Since > 5 x 10(6) dendritic cells develop in 1 wk from precursors within the large hind limb bones of a single animal, marrow progenitors can act as a major source of dendritic cells. This feature should prove useful for future molecular and clinical studies of this otherwise trace cell type.

CD34+ cells in human cord blood and marrow are known to give rise to dendritic cells (DC), as well as to other myeloid lineages. CD34+ cells are rare in adult blood, however, making it difficult to use CD34+ cells to ascertain if DC progenitors are present in the circulation and if blood can be a starting point to obtain large numbers of these immunostimulatory antigen-presenting cells for clinical studies. A systematic search for DC progenitors was therefore carried out in several contexts. In each case, we looked initially for the distinctive proliferating aggregates that were described previously in mice. In cord blood, it was only necessary to deplete erythroid progenitors, and add granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) together with tumor necrosis factor (TNF), to observe many aggregates and the production of typical DC progeny. In adult blood from patients receiving CSFs after chemotherapy for malignancy, GM-CSF and TNF likewise generated characteristic DCs from HLA-DR negative precursors. However, in adult blood from healthy donors, the above approaches only generated small DC aggregates which then seemed to become monocytes. When interleukin 4 was used to suppress monocyte development (Jansen, J. H., G.-J. H. M. Wientjens, W. E. Fibbe, R. Willemze, and H. C. Kluin-Nelemans. 1989. J. Exp. Med. 170:577.), the addition of GM-CSF led to the formation of large proliferating DC aggregates and within 5-7 d, many nonproliferating progeny, about 3-8 million cells per 40 ml of blood. The progeny had a characteristic morphology and surface composition (e.g., abundant HLA-DR and accessory molecules for cell-mediated immunity) and were potent stimulators of quiescent T cells. Therefore, large numbers of DCs can be mobilized by specific cytokines from progenitors in the blood stream. These relatively large numbers of DC progeny should facilitate future studies of their Fc epsilon RI and CD4 receptors, and their use in stimulating T cell-mediated resistance to viruses and tumors.

Two methods to generate human dendritic cells from hematopoietic precursor cells in peripheral blood have recently been published. One approach utilizes the rare CD34+ precursors and GM-CSF plus TNF-α. The other method makes use of the more abundant CD34− precursor population and GM-CSF plus IL-4. Here we report a method that is based on the latter approach. However, the GM-CSF and IL-4 treated cells are not stable mature dendritic cells, e.g., the characteristic morphology and nonadherence of dendritic cells is lost if the cytokines are removed. We describe the need for a monocyte-conditioned medium to generate fully mature and stable dendritic cells. This is achieved by adding a 3 day 'maturation culture' to the initial 6–7 day culture in the presence of GM-CSF and IL-4. Macrophage-conditioned medium contains the critical maturation factors. Mature dendritic cells are defined by their pronounced display of motile cytoplasmic processes ('veils'), their high capacity to induce proliferative responses in resting T cells, particularly in naive umbilical cord T cells, their down-regulated antigen processing ability, and their characteristic phenotype: expression of CD83, high levels of MHC molecules and CD86, lack of CD115 and perinuclear dot-like CD68 staining. These features are stable for at least 3 days upon withdrawal of cytokines and conditioned media. IL-4 can be replaced by IL-13. When CD34+ progenitors are depleted from blood, there is only a minor reduction in the yield of dendritic cells by this method. We have adapted the method to consider several variables that are pertinent to clinical use, including a change from fetal calf serum to human plasma and to media approved for clinical use like X-VIVO or AIM-V. 1% plasma and RPMI 1640 are currently optimal. Additional reagents used for cell culture (Ig, cytokines) and cell separation (immunomagnetic beads) are approved for or already used in clinical applications. For 40 ml blood, the yield is 0.8–3.3 × 106 mature dendritic cells as defined by the expression of the new dendritic cell-restricted marker CD83. CD83+ cells constitute between 30 and 80% of all cells recovered at the end of the culture period. Yields can be enhanced up to six-fold if the blood donors are pretreated with G-CSF. Stable, mature dendritic cells generated by this method should be a powerful tool for active immunotherapy.

We have shown previously that dendritic cells (DC) produce IL-12 upon interaction with CD4+ T cells. Here we ask how this IL-12 production is induced and regulated. Quantitative PCR and in situ hybridization for IL-12 p40 and an ELISA specific for the p70 heterodimer were used to determine IL-12 production. We demonstrate that ligation of either CD40 or MHC class II molecules independently trigger IL-12 production in DC, and that IL-12 production is downregulated by IL-4 and IL-10. The levels of bioactive IL-12 that can be released by triggering with an anti-CD40 mAb or with a T cell hybridoma are high (range 260-4700 pg/ml from 1 X 10(6) DC in 72 h). The CD40-mediated pathway indicates that IL-12 production is induced in DC upon interaction with activated, CD40 ligand-expressing helper T cells, even in the absence of cognate antigen recognition. Side-by-side comparison of IL-12 production, and blocking experiments employing an anti-CD40 ligand mAb, suggest that the CD40-mediated pathway is quantitatively more significant than induction via the MHC class II molecule. The importance of the CD40/CD40 ligand interaction for IL-12 induction in DC likely contributes to the recent finding that mice lacking the CD40 ligand are impaired in mounting Th1 type cell-mediated immune responses.

Langerhans cells (LCs) are prominent dendritic cells (DCs) in epithelia, but their role in immunity is poorly defined. To track and discriminate LCs from dermal DCs in vivo, we developed knockin mice expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP) under the control of the langerin (CD207) gene. By using vital imaging, we showed that most EGFP+ LCs were sessile under steady-state conditions, whereas skin inflammation induced LC motility and emigration to lymph nodes (LNs). After skin immunization, dermal DCs arrived in LNs first and colonized areas distinct from slower migrating LCs. LCs reaching LNs under steady-state or inflammatory conditions expressed similar levels of costimulatory molecules. Langerin and EGFP were also expressed on thymic DCs and on blood-derived, CD8α+ DCs from all secondary lymphoid organs. By using a similar knockin strategy involving a diphtheria toxin receptor (DTR) fused to EGFP, we demonstrated that LCs were dispensable for triggering hapten-specific T cell effectors through skin immunization.

Abstract Interleukin‐12 (IL‐12), a 70‐kDa heterodimeric cytokine composed of covalently linked p35 and p40 chains, is to date the most critical factor for skewing the immune response towards a T helper 1 (Th1) of cytokine profile [high interferon‐γ (IFN‐γ), low IL‐4]. Established sources of IL‐12 are stimulated macrophages, neutrophils and B cells. As dendritic cells (DC) process antigen in the periphery and then migrate to lymphoid organs to sensitize T cells and induce cell‐mediated immunity, we reasoned that DC should constitute a critical source of IL‐12. The criteria used to detect IL‐12 in DC were the demonstration of p40 and p35 mRNA (semiquantitative polymerase chain reaction, Northern blotting, and in situ hybridization) as well as IL‐12 protein (p70 enzyme‐linked immunosorbent assay, p70 antigen capture followed by IFN‐γ bioassay, free p40 chain radioimmunoassay or immunoprecipitation). We found that conventional stimuli such as Staphylococcus aureus induced production of IL‐12 bymurine as well as human DC in amounts comparable to spleen cells, peritoneal macrophages or peripheral blood mononuclear cells. DC exhibited, however, features that had not been seen with other antigen‐presenting cells: they produced bioactive IL‐12 upon antigen‐specific interaction with T cells without any other stimuli; in an allogeneic mixed leukocyte reaction model, neutralizing anti‐IL‐12 antibodies showed that DC‐derived IL‐12 was critical for optimal proliferation and IFN‐γ production by activated Th1 blasts; and finally, the priming of resting, naive allogeneic T cells by DC, followed by restimulation of primed T blasts by DC, skewed the response to Th1 without the need for any exogenous cytokines or stimuli such as microorganisms. This skewing to Th1 cytokine production, which depended on DC‐derived IL‐12, but did not require anti‐IL‐4, exogenous IL‐12, or microbes, might be a major function of DC.

The capacity of dendritic cells to present protein antigens has been studied with two MHC class II-restricted, myoglobin-specific, T cell clones. Spleen dendritic cells and cultured epidermal Langerhans cells (LC) presented native myoglobin weakly and often not at all. These same populations were powerful stimulators of allogeneic T cells in the primary MLR. Freshly isolated LC were in contrast very active in presenting proteins to T cell clones but were weak stimulators of the MLR. Both fresh and cultured LC could present specific peptide fragments of myoglobin to the clones. These results suggest that dendritic cells in nonlymphoid tissues like skin can act as sentinels for presenting antigens in situ, their accessory function developing in two phases. First antigens are captured and appropriately presented. Further handling of antigen then is downregulated while the cells acquire strong sensitizing activity for the growth and function of resting T lymphocytes. The potent MLR stimulating activity of cultured epidermal LC and lymphoid dendritic cells probably reflects prior handling of antigens leading to the formation of allogeneic MHC-peptide complexes.

Experimentally, a productive infection with HIV-1 requires that virus be administered to T cells that are activated by mitogens. We describe a productive milieu for HIV-1 within the confines of normal skin that does not require standard stimuli. The milieu consists of dendritic cells and T cells that emigrate from skin and produce distinctive stable, nonproliferating conjugates. These conjugates, upon exposure to each of seven different HIV-1 isolates, begin to release high levels of virus progeny within 4 days. Numerous infected syncytia, comprised of both dendritic and T cells, rapidly develop. We propose that conjugates of dendritic cells and T cells, as found in the external linings of organs involved in sexual transmission of HIV-1, represent an important site for the productive phase of HIV-1 infection. Because the affected T cells carry the memory phenotype, this site additionally provides a mechanism for the chronic depletion of CD4+ memory cells in HIV-1 disease.

There is consensus that an optimized cancer vaccine will have to induce not only CD8+ cytotoxic but also CD4+ T helper (Th) cells, particularly interferon (IFN)-γ–producing, type 1 Th cells. The induction of strong, ex vivo detectable type 1 Th cell responses has not been reported to date. We demonstrate now that the subcutaneous injection of cryopreserved, mature, antigen-loaded, monocyte-derived dendritic cells (DCs) rapidly induces unequivocal Th1 responses (ex vivo detectable IFN-γ–producing effectors as well as proliferating precursors) both to the control antigen KLH and to major histocompatibility complex (MHC) class II–restricted tumor peptides (melanoma-antigen [Mage]-3.DP4 and Mage-3.DR13) in the majority of 16 evaluable patients with metastatic melanoma. These Th1 cells recognized not only peptides, but also DCs loaded with Mage-3 protein, and in case of Mage-3DP4–specific Th1 cells IFN-γ was released even after direct recognition of viable, Mage-3–expressing HLA-DP4+ melanoma cells. The capacity of DCs to rapidly induce Th1 cells should be valuable to evaluate whether Th1 cells are instrumental in targeting human cancer and chronic infections.