Activation of AMP-activated kinase (AMPK) in skeletal muscle increases glucose uptake, fatty acid oxidation, and mitochondrial biogenesis by increasing gene expression in these pathways. However, the transcriptional components that are directly targeted by AMPK are still elusive. The peroxisome-proliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha (PGC-1alpha) has emerged as a master regulator of mitochondrial biogenesis; furthermore, it has been shown that PGC-1alpha gene expression is induced by exercise and by chemical activation of AMPK in skeletal muscle. Using primary muscle cells and mice deficient in PGC-1alpha, we found that the effects of AMPK on gene expression of glucose transporter 4, mitochondrial genes, and PGC-1alpha itself are almost entirely dependent on the function of PGC-1alpha protein. Furthermore, AMPK phosphorylates PGC-1alpha directly both in vitro and in cells. These direct phosphorylations of the PGC-1alpha protein at threonine-177 and serine-538 are required for the PGC-1alpha-dependent induction of the PGC-1alpha promoter. These data indicate that AMPK phosphorylation of PGC-1alpha initiates many of the important gene regulatory functions of AMPK in skeletal muscle.

We measured production of reactive oxygen species by intact mitochondria from rat skeletal muscle, heart, and liver under various experimental conditions. By using different substrates and inhibitors, we determined the sites of production (which complexes in the electron transport chain produced superoxide). By measuring hydrogen peroxide production in the absence and presence of exogenous superoxide dismutase, we established the topology of superoxide production (on which side of the mitochondrial inner membrane superoxide was produced). Mitochondria did not release measurable amounts of superoxide or hydrogen peroxide when respiring on complex I or complex II substrates. Mitochondria from skeletal muscle or heart generated significant amounts of superoxide from complex I when respiring on palmitoyl carnitine. They produced superoxide at considerable rates in the presence of various inhibitors of the electron transport chain. Complex I (and perhaps the fatty acid oxidation electron transfer flavoprotein and its oxidoreductase) released superoxide on the matrix side of the inner membrane, whereas center o of complex III released superoxide on the cytoplasmic side. These results do not support the idea that mitochondria produce considerable amounts of reactive oxygen species under physiological conditions. Our upper estimate of the proportion of electron flow giving rise to hydrogen peroxide with palmitoyl carnitine as substrate (0.15%) is more than an order of magnitude lower than commonly cited values. We observed no difference in the rate of hydrogen peroxide production between rat and pigeon heart mitochondria respiring on complex I substrates. However, when complex I was fully reduced using rotenone, rat mitochondria released significantly more hydrogen peroxide than pigeon mitochondria. This difference was solely due to an elevated concentration of complex I in rat compared with pigeon heart mitochondria. We measured production of reactive oxygen species by intact mitochondria from rat skeletal muscle, heart, and liver under various experimental conditions. By using different substrates and inhibitors, we determined the sites of production (which complexes in the electron transport chain produced superoxide). By measuring hydrogen peroxide production in the absence and presence of exogenous superoxide dismutase, we established the topology of superoxide production (on which side of the mitochondrial inner membrane superoxide was produced). Mitochondria did not release measurable amounts of superoxide or hydrogen peroxide when respiring on complex I or complex II substrates. Mitochondria from skeletal muscle or heart generated significant amounts of superoxide from complex I when respiring on palmitoyl carnitine. They produced superoxide at considerable rates in the presence of various inhibitors of the electron transport chain. Complex I (and perhaps the fatty acid oxidation electron transfer flavoprotein and its oxidoreductase) released superoxide on the matrix side of the inner membrane, whereas center o of complex III released superoxide on the cytoplasmic side. These results do not support the idea that mitochondria produce considerable amounts of reactive oxygen species under physiological conditions. Our upper estimate of the proportion of electron flow giving rise to hydrogen peroxide with palmitoyl carnitine as substrate (0.15%) is more than an order of magnitude lower than commonly cited values. We observed no difference in the rate of hydrogen peroxide production between rat and pigeon heart mitochondria respiring on complex I substrates. However, when complex I was fully reduced using rotenone, rat mitochondria released significantly more hydrogen peroxide than pigeon mitochondria. This difference was solely due to an elevated concentration of complex I in rat compared with pigeon heart mitochondria. The free radical theory of aging states that it is the mitochondrial production of reactive oxygen species (ROS), 1The abbreviations used are: ROS, reactive oxygen species; MLSP, maximum lifespan; ETF, electron transfer flavoprotein; QOR, quinone oxidoreductase; UCPs, uncoupling proteins; SOD, superoxide dismutase; BSA, bovine serum albumin. such as superoxide and hydrogen peroxide, and the resulting accumulation of damage to macromolecules that causes aging and determines maximum lifespan (MLSP) (1Harman D. J. Gerontol. 1956; 2: 298-300Google Scholar, 2Harman D. J. Am. Geriatr. Soc. 1972; 20: 145-147Google Scholar). Comparative approaches have shed considerable light on the relationship between ROS and MLSP. Notably, the rate of superoxide production by submitochondrial particles (3Sohal R.S. Svensson I. Sohal B.H. Brunk U.T. Mech. Ageing Dev. 1989; 49: 129-135Google Scholar) and the rate of H2O2 production by mitochondria (4Sohal R.S. Svensson I. Brunk U.T. Mech. Ageing Dev. 1990; 53: 209-215Google Scholar) are inversely related to MLSP in different species. A complicating factor is the association of longer MLSP with lower metabolic rates within mammals or other groups, but this complication has been resolved by the observation that birds tend to have longer MLSP than mammals with the same metabolic rate. Thus pigeons (long MLSP) have a lower rate of mitochondrial H2O2 production than rats (shorter MLSP), even though these two species have similar standard metabolic rates (5Ku H.H. Sohal R.S. Mech. Ageing Dev. 1993; 72: 67-76Google Scholar, 6Barja G. Cadenas S. Rojas C. Perez-Campo R. Lopez-Torres M. Free Radic. Res. 1994; 21: 317-327Google Scholar, 7Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1997; 98: 95-111Google Scholar, 8Herrero A. Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 241-249Google Scholar). Similarly, canaries and parakeets (budgerigars) (long MLSP) have lower rates of mitochondrial H2O2 production than mice (shorter MLSP), although all three species have similar standard metabolic rates (9Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1998; 103: 133-146Google Scholar). Despite numerous studies reporting that mitochondria release H2O2, there is some controversy as to whether mitochondria are an important source of ROS under physiological and pathological conditions (10Forman H.J. Azzi A. FASEB J. 1997; 11: 374-375Google Scholar). In agreement with these concerns, Staniek and Nohl (12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar) reported that mitochondria respiring on complex I and complex II substrates do not generate H2O2 except in the presence of the complex III inhibitor antimycin A. They proposed that unspecific interactions between the commonly used methods of H2O2detection and mitochondria cause artificial rates of H2O2 production (11Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 1999; 1413: 70-80Google Scholar, 12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar). Two principal sites of superoxide generation have been identified in mitochondria: complex I and complex III. The relative importance of these two sites seems to vary with experimental conditions and between tissues and species (13Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1999; 31: 347-366Google Scholar). There is no clear consensus in the literature about which side of the mitochondrial inner membrane superoxide is generated by complex I and complex III. In the traditional view, complex III generates superoxide on the matrix side of the mitochondrial inner membrane (14Turrens J.F. Biosci. Rep. 1997; 17: 3-8Google Scholar). The semiquinone at centero of complex III of heart mitochondria was shown to be the main producer of superoxide based on inhibitor studies (15Turrens J.F. Alexandre A. Lehninger A.L. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 237: 408-414Google Scholar). However, the x-ray structure of complex III reveals that center o is oriented toward the intermembrane space (16Iwata S. Lee J.W. Okada K. Lee J.K. Iwata M. Rasmussen B. Link T.A. Ramaswamy S. Jap B.K. Science. 1998; 281: 64-71Google Scholar, 17Zhang Z. Huang L. Shulmeister V.M. Chi Y.I. Kim K.K. Hung L.W. Crofts A.R. Berry E.A. Kim S.H. Nature. 1998; 392: 677-684Google Scholar), suggesting that superoxide production by complex III is directed toward the cytoplasm and not toward the matrix. In support of this view, a recent study has reported that antimycin A-supplemented mitoplasts (mitochondria devoid of portions of outer membrane and cytochrome c) can release superoxide (18Han D. Williams E. Cadenas E. Biochem. J. 2001; 353: 411-416Google Scholar). In complex I, either the iron-sulfur centers (7Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1997; 98: 95-111Google Scholar, 19Genova M.L. Ventura B. Giuliano G. Bovina C. Formiggini G. Parenti Castelli G. Lenaz G. FEBS Lett. 2001; 505: 364-368Google Scholar) or the active site flavin (20Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Google Scholar) are thought to be mainly responsible for superoxide production. There is no x-ray crystal structure of complex I, but all of these centers are likely to face the matrix side of the membrane. 30 years ago, it was shown that the oxidation of palmitoyl carnitine by mitochondria leads to the generation of H2O2(21Boveris A. Oshino N. Chance B. Biochem. J. 1972; : 617-630Google Scholar, 22Boveris A. Chance B. Biochem. J. 1973; 134: 707-716Google Scholar). These results received little attention and, to our knowledge, no study has examined how lipid metabolism could cause ROS generation in mammalian mitochondria. The oxidation of fatty acids involves the electron transfer flavoprotein (ETF) and the electron transfer flavoprotein quinone oxidoreductase (ETF-QOR) that could act as potential sources of ROS production. The role of lipid metabolism in the generation of ROS by mitochondria gained our attention recently when it was shown that the expression of mitochondrial uncoupling proteins (UCPs) correlates with the use of lipid as fuel substrates (23Samec S. Seydoux J. Dulloo A.G. Faseb J. 1998; 12: 715-724Google Scholar, 24Cadenas S. Buckingham J.A. Samec S. Seydoux J. Din N. Dulloo A.G. Brand M.D. FEBS Lett. 1999; 462: 257-260Google Scholar) and that UCPs are activated by superoxide (25Echtay K.S. Roussel D. St-Pierre J. Jekabsons M.B. Cadenas S. Stuart J.A. Harper J.A. Roebuck S.J. Morrison A. Pickering S. Clapham J.C. Brand M.D. Nature. 2002; 415: 96-99Google Scholar). An interesting hypothesis is that the elevated expression of UCPs during increased reliance on lipid metabolism is a part of a mechanism to protect against high levels of ROS production during the oxidation of fatty acids. In light of the controversy regarding the production of H2O2 by mitochondria and its relevance to aging, additional studies to characterize the generation of ROS by mitochondria are required. The aims of the present study were 1) to quantify the production of ROS by intact mitochondria from different tissues, 2) to identify the electron transport sites involved in ROS generation, 3) to determine the topology of ROS production, on which side of the inner membrane ROS are produced, and 4) to re-examine differences in the production of ROS by heart mitochondria from rat and pigeon, species with similar standard metabolic rate but markedly different MLSP. The horseradish peroxidase, homovanillic acid, superoxide dismutase (SOD), and hydrogen peroxide solution, were purchased from Sigma. The substrates (malate, pyruvate, succinate, carnitine, and palmitoyl carnitine), inhibitors (rotenone, antimycin A, myxothiazol, and oligomycin), and bovine serum albumin (BSA) were also obtained from Sigma. Female Wistar rats aged between 5 and 8 weeks were used. Pigeons were provided by Abbott Brothers, Norfolk, UK. Skeletal muscle, heart, and liver mitochondria were isolated as described (26Rolfe D.F. Hulbert A.J. Brand M.D. Biochim. Biophys. Acta. 1994; 1188: 405-416Google Scholar), resuspended in standard assay medium containing 120 mm KCl, 5 mmKH2PO4, 3 mm Hepes, 1 mm EGTA, and 0.3% BSA (pH 7.2 at 20 °C) and kept on ice. Mitochondria were of good quality (at least 3-fold increase in respiration rate in the presence of an uncoupler). Protein content was determined using the Biuret method (27Gornall A.G. Bardawill C.J. David M.M.J. J. Biol. Chem. 1949; 177: 751-766Google Scholar) with BSA as standard. The rate of mitochondrial production of H2O2 was determined by following its reaction with homovanillic acid in the presence of horseradish peroxidase (28Barja G. Yu B.P. Methods in Aging Research. CRC Press, Boca Raton, FL1999: 533-548Google Scholar) using a Shimadzu RF5301 PC spectrofluorophotometer. Rat and pigeon mitochondria were incubated at 0.4 mg/ml at 37 °C and 41 °C, respectively, in standard assay medium. The following reactants were incorporated to the standard assay medium at the final concentrations indicated in parentheses. First, horseradish peroxidase (12 units/ml; one unit forms 18 μm per min of purpurogallin from pyrogallol at 25 °C) and homovanillic acid (0.1 mm) were added and a 3-min incubation period was allowed for temperature equilibration. Oligomycin (1 μg/mg mitochondrial protein), an inhibitor of the F1Fo-ATP synthase, was added to prevent ATP synthesis. Production of H2O2 was started by adding substrate: malate (1 mm) and pyruvate (2.5 mm) for complex I; succinate (5 mm), in the presence of rotenone (10 μm), for complex II or palmitoyl carnitine (60 μm), in the presence of l-carnitine (2 mm), as a lipid-derived substrate. Oxidation of palmitoyl carnitine generates equal amounts of NADH2, which enters the electron transport chain at complex I, and FADH2, which enters via the ETF and ETF-QOR. Calibration curves were obtained by adding known amounts of H2O2 to assay medium in the presence of the reactants (homovanillic acid and horseradish peroxidase). They were performed in the absence and presence of mitochondria to establish whether any mitochondrial components interfered with the assay. Standard curves were linear up to 6 μm H2O2 (Fig.1). Mitochondria quenched the fluorescence: the slopes of the standard curves obtained in the presence of liver, skeletal muscle, and heart mitochondria were 66, 81 and 86%, respectively, of the slope of the control curve without mitochondria (Fig. 1). Fig. 2 illustrates the effects of various corrections that we applied to the rates of H2O2 production using skeletal muscle as an example. Horseradish peroxidase and SOD were in excess in the experiments since doubling the final concentration of these enzymes did not affect the results (data not shown). Rates of mitochondrial H2O2 production were higher if calculated using the standard curve with mitochondria than using the control standard curve (Fig. 2; compare the black and white bars). There were significant rates of apparent H2O2production in the absence of mitochondria (calibrated using the control standard curve). SOD, added at 50 units/ml (one unit inhibits the rate of reduction of cytochrome c by 50% in a coupled system with xanthine and xanthine oxidase at pH 7.8 at 25 °C in a 3-ml reaction volume), caused significant interference to the detection method, increasing the fluorescence signal under all conditions (Fig.2, gray bars, and Fig. 3). The final rates of H2O2 production (fully corrected signals; dotted bars in Fig. 2) were obtained by subtracting the rates measured in the absence of mitochondria (calibrated without mitochondria: gray bars) from the rates measured in the presence of mitochondria (calibrated with mitochondria; white bars). All the following results represent fully corrected rates of H2O2 production.Figure 3Fluorometric traces of H2O2 production in the presence of malate and pyruvate (MP), oligomycin (O), and SOD. The figure shows typical traces obtained in the absence and presence of mitochondria illustrating the interference of SOD with the detection method.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) Various inhibitors of electron transport were used to define more precisely the sites of ROS production (28Barja G. Yu B.P. Methods in Aging Research. CRC Press, Boca Raton, FL1999: 533-548Google Scholar). Rotenone inhibits complex I, while myxothiazol (used at 0.625 nmol/mg protein) and antimycin A (used at 0.625 nmol/mg protein) inhibit centero and center i of complex III respectively. To determine which side of the mitochondrial inner membrane superoxide (O 2⨪) was generated, we measured the rate of H2O2 production in the presence and absence of exogenous SOD. If mitochondria produce O 2⨪ on the cytoplasmic face of the inner membrane, addition of exogenous SOD will increase the natural dismutation rate of O 2⨪ (and that catalyzed by any contaminating or endogenous SOD) and compete with other side reactions, leading to an elevated rate of H2O2 production. If mitochondria generate O 2⨪ on the matrix side of the inner membrane, much of it will be converted to H2O2by the matrix SOD. H2O2 will diffuse out, and there will be no difference in the rates of extramitochondrial H2O2 appearance in the presence and absence of exogenous SOD. Complex I concentration was measured as described by Burch (29Burch H. Methods Enzymol. 1957; 3: 960-963Google Scholar). Statistical analyses were performed using Sigma Stat 2.0. The H2O2 production rate of mitochondria from a given tissue with a given substrate was compared between different experimental conditions using one-way analysis of variance and the a posteriori Tukey test. Comparisons between rat and pigeon heart mitochondria were carried out using a paired t test. The level of significance wasp = 0.05. The rate of H2O2 production by skeletal muscle or heart mitochondria incubated with malate and pyruvate was very low and was not increased by addition of SOD (Figs.4 A and 5 A). However, the addition of rotenone to mitochondria respiring on malate and pyruvate induced a significant rate of H2O2generation (Figs. 4 A and5 A). This rotenone-stimulated H2O2 production came primarily from the matrix side of the inner membrane since the signal was insensitive to addition of exogenous SOD (Figs. 4 A and 5 A). These results indicate that complex I in skeletal muscle and heart mitochondria can generate superoxide on the matrix side of the inner membrane when it is fully reduced and inhibited by rotenone but that the rate measured when the complex is not inhibited by rotenone is extremely low.Figure 5Rates of H2O2production by rat heart mitochondria. Values are means ± S.E. A, malate plus pyruvate as substrates;n = 5–7. B, succinate (plus rotenone) as substrate; n = 5. C, palmitoyl carnitine (plus carnitine) as substrate; n = 4. Statistical significance (as in Fig. 4) is indicated by different letters.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) There was no detectable rate of H2O2 production when skeletal muscle or heart mitochondria were fed succinate (in the presence of rotenone) in the absence or presence of SOD (Figs.4 B and 5 B). There was little or no rate of H2O2 production in the presence of myxothiazol in the absence or presence of SOD (Figs. 4 B and5 B), showing that neither complex II nor the ubiquinone pool can produce significant amounts of O 2⨪ on either side of the membrane when they are extensively reduced. Addition of antimycin A led to a low but measurable rate of H2O2 production (Figs. 4 B and5 B) that was significantly increased by addition of exogenous SOD (Figs. 4 B and 5 B). These results indicate that center o of complex III can generate O 2⨪ on the cytoplasmic face of the inner membrane of skeletal muscle or heart mitochondria when it is reduced following inhibition of the complex at center i by antimycin A but that the rate measured when the complex is not inhibited by antimycin A is extremely low. There was some H2O2 production in the presence of antimycin A even without exogenous SOD, which might suggest that center o can also produce O 2⨪ on the matrix side of the inner membrane. However, even if mitochondria only produce O 2⨪ on the cytoplasmic face of the membrane, there will be a detectable rate of H2O2 production without exogenous SOD because of contaminating or endogenous SOD and the natural dismutation of O 2⨪ into H2O2. In other words, if a rate of H2O2 production has a SOD-sensitive and a SOD-insensitive part, we can state that the SOD-sensitive part emanates from the cytoplasmic face of the membrane but we cannot be certain whether the SOD-insensitive part represents the natural dismutation rate of O 2⨪ coming from the cytoplasmic face of the membrane or H2O2 coming from the matrix side of the membrane. Skeletal muscle or heart mitochondria respiring on palmitoyl carnitine had a significant rate of H2O2 production that was not significantly increased by addition of SOD (Figs. 4 Cand 5 C). This result indicates that oxidation of palmitoyl carnitine (unlike oxidation of malate and pyruvate or succinate plus rotenone) leads to significant ROS production and that this ROS is produced mostly on the matrix side of the inner membrane. The addition of rotenone led to a slight increase in the rate of H2O2 production that did not reach statistical significance and was SOD-insensitive (Figs. 4 C and5 C). The rates of H2O2 production in the presence of palmitoyl carnitine and rotenone were very similar to those in the presence of malate, pyruvate, and rotenone (Figs.4 A and 5 A), suggesting that complex I was the source of this ROS with either substrate when complex I was fully reduced in the presence of rotenone. In the absence of rotenone, perhaps complex I is more reduced with palmitoyl carnitine as substrate (due to reversed electron transport and competition with ETF-QOR for oxidized Q) than it is with malate and pyruvate, leading to greater endogenous ROS production from complex I with palmitoyl carnitine. In the presence of palmitoyl carnitine, the addition of myxothiazol led to an increase in the rate of H2O2 production that did not reach statistical significance in skeletal muscle mitochondria and was SOD-insensitive (Figs. 4 C and5 C). Under these conditions complex I, complex II, ETF-QOR, and the ubiquinone pool may all be strongly reduced. H2O2 production with palmitoyl carnitine plus myxothiazol was slightly (but not significantly) greater than with palmitoyl carnitine plus rotenone (Figs. 4 C and5 C); if this effect was real, it may be that ETF-QOR and ETF can also produce some O 2⨪ on the matrix side of the membrane. Complex II and the ubiquinone pool would not be the source of such O 2⨪ because there was no H2O2production in the presence of succinate and myxothiazol (Figs.4 B and 5 B). Addition of antimycin A to skeletal muscle or heart mitochondria supplemented with palmitoyl carnitine greatly increased the rate of H2O2 production (Figs. 4 C and5 C). This rate was increased by addition of SOD (in skeletal muscle mitochondria), showing that much of it was due to production of O 2⨪ on the cytoplasmic face of the inner membrane. Under these conditions complex I, complex II, ETF-QOR, the ubiquinone pool, and center o of complex III may all be strongly reduced. In the presence of SOD, H2O2 production with palmitoyl carnitine plus antimycin A appeared to be higher than the sum of the individual contributions from complex I, complex II, ETF-QOR, the ubiquinone pool, and center o of complex III. The reason for this discrepancy is unclear. In general, the rates of H2O2production of liver mitochondria were lower than those of skeletal muscle and heart mitochondria, particularly with succinate or with palmitoyl carnitine as substrate (compare Figs. 4, 5, and6), making reliable interpretations difficult. Liver mitochondria respiring on malate and pyruvate, produced less than 0.2 nmol H2O2/min/mg mitochondrial protein in the absence or presence of SOD (Fig.6 A). The addition of rotenone did not increase H2O2 production, but SOD appeared to increase the rate of H2O2 production in the presence of rotenone (Fig. 6 A). These results appear to suggest that complex I from liver mitochondria generates ROS on the cytoplasmic face of the inner membrane as well as on the matrix side, but because of the small signal we consider them to be unreliable. Liver mitochondria respiring on succinate did not generate H2O2 (Fig. 6 B), except perhaps for a small signal in the presence of SOD and antimycin A or myxothiazol. Liver mitochondria respiring on palmitoyl carnitine did not produce H2O2 (Fig. 6 C), except perhaps for a small signal in the presence of rotenone, antimycin A, or myxothiazol. However, the rates of H2O2 production were minimal, making it difficult to interpret their significance. In a separate series of experiments, neither rat nor pigeon heart mitochondria generated measurable amounts of H2O2 when supplemented with malate and pyruvate (Fig.7 A). The addition of rotenone increased the rate of H2O2 production in both species (Fig. 7 A). In the presence of rotenone, the H2O2 production rate per mg of mitochondrial protein was higher with rat mitochondria than pigeon mitochondria (Fig.7 A). The amount of complex I present in the two types of mitochondria was measured (Fig. 7 B) to see whether the greater capacity of rat heart mitochondria to produce ROS in the presence of rotenone was caused by a greater concentration of complex I. Complex I was significantly greater in rat mitochondria than in pigeon mitochondria. Fig. 7 C shows that the different capacities for ROS production between rat and pigeon heart mitochondria were lost when H2O2 production rate was expressed per mole of complex I. Mitochondria from rat skeletal muscle, heart, and liver respiring on substrates feeding exclusively to complex I (malate plus pyruvate) or complex II (rotenone plus succinate) in the absence of other inhibitors generated little or no measurable H2O2 (Figs. 4, 5, and 6). The absence of significant generation of H2O2 from mitochondria respiring on complex I and complex II substrates supports results from Staniek and Nohl (12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar) showing a lack of H2O2 production from rat heart mitochondria respiring on glutamate/malate, malate/pyruvate, and succinate. Hansfordet al. (36Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Google Scholar) and Liu et al. (20Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Google Scholar) also reported minimal rates of H2O2 production from rat heart, brain, or liver mitochondria with glutamate/malate or rotenone/succinate as substrates. In the absence of rotenone, succinate supports considerable ROS production from complex I by reverse electron transport (e.g. see Ref. 20Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Google Scholar); this aspect was not pursued in the present paper. However, many other studies have reported significant rates of H2O2 production in isolated mitochondria (reviewed in Ref. 13Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1999; 31: 347-366Google Scholar). Most of these studies used SOD in the assay (6Barja G. Cadenas S. Rojas C. Perez-Campo R. Lopez-Torres M. Free Radic. Res. 1994; 21: 317-327Google Scholar, 7Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1997; 98: 95-111Google Scholar, 8Herrero A. Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 241-249Google Scholar, 30Barja G. Herrero A. J. Bioenerg. Biomembr. 1998; 30: 235-243Google Scholar). We obtained considerable rates of H2O2 generation in the presence of SOD if we did not correct for background effects (Fig. 2). Therefore, some of the discrepancies in production of H2O2 by mitochondria respiring on complex I and II substrates between various studies might be due to the presence or absence of inhibitors of reversed electron transport or to methodological artifacts as suggested by Forman and Azzi (10Forman H.J. Azzi A. FASEB J. 1997; 11: 374-375Google Scholar) and Staniek and Nohl (12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar). In contrast, rat skeletal muscle and heart mitochondria produced H2O2 at measurable rates when respiring on palmitoyl carnitine with no added inhibitors (Figs. 4 and 5). This H2O2 was produced primarily on the matrix side of the membrane, since it was not significantly enhanced by addition of exogenous SOD. The greater H2O2 production with palmitoyl carnitine than with complex I substrates could be because complex I is more reduced with palmitoyl carnitine, due to reversed electron transport and competition with ETF-QOR for oxidized Q. Greater steady-state reduction of complex I would lead to greater matrix ROS production with palmitoyl carnitine as substrate. Additionally, it could be that ETF-QOR and ETF can also produce O 2⨪ on the matrix side of the membrane when palmitoyl carnitine is added. ETF accepts electrons from eight primary dehydrogenases in the mitochondrial matrix including those of the β-oxidation cycle. ETF is rapidly reduced to the semiquinone form (ETF 2⨪) and more slowly to the fully reduced form, suggesting that ETF 2⨪ is the electron donor to ETF-QOR (31Ramsay R.R. Steenkamp D.J. Husain M. Biochem. J. 1987; 241: 883-892Google Scholar). ETF-QOR can be fully reduced by accepting three electrons, but it accepts only two electrons when ETF is the electron donor (32Beckmann J.D. Frerman F.E. Biochemistry. 1985; 24: 3913-3921Google Scholar). It was proposed that the FAD prosthetic group of ETF-QOR cycles between the oxidized and semiquinone forms (31Ramsay R.R. Steenkamp D.J. Husain M. Biochem. J. 1987; 241: 883-892Google Scholar). These data suggest that ETF and ETF-QOR could act as generators of superoxide owing to their presence in partially reduced states during lipid metabolism. Early papers on the production of H2O2 by mitochondria showed that rat liver and pigeon heart mitochondria release H2O2 when respiring on 10 μm palmitoyl carnitine (21Boveris A. Oshino N. Chance B. Biochem. J. 1972; : 617-630Google Scholar, 22Boveris A. Chance B. Biochem. J. 1973; 134: 707-716Google Scholar). These results gained little attention since succinate gave higher rates of H2O2 production. However, the lower rates of H2O2 production with palmitoyl carnitine in these early reports might reflect the absence of catalytic carnitine and the use of subsaturating concentrations of palmitoyl carnitine. It is tempting to speculate that increased production of ROS by mitochondria during lipid metabolism might lead to an increase in the expression and activity of UCPs to counteract the deleterious effects of ROS on mitochondria. In fact, UCP2 and UCP3 expression is increased when fatty acids are high (23Samec S. Seydoux J. Dulloo A.G. Faseb J. 1998; 12: 715-724Google Scholar, 24Cadenas S. Buckingham J.A. Samec S. Seydoux J. Din N. Dulloo A.G. Brand M.D. FEBS Lett. 1999; 462: 257-260Google Scholar). Fatty acids and superoxide activate uncoupling by UCPs, and it was recently suggested that the primary role of UCP2 and UCP3 might be for protection against ROS (25Echtay K.S. Roussel D. St-Pierre J. Jekabsons M.B. Cadenas S. Stuart J.A. Harper J.A. Roebuck S.J. Morrison A. Pickering S. Clapham J.C. Brand M.D. Nature. 2002; 415: 96-99Google Scholar). It is commonly repeated that 2% of electron flow during mitochondrial respiration gives rise to H2O2 (33Chance B. Sies H. Boveris A. Physiol. Rev. 1979; 59: 527-605Google Scholar). More recently, Hansford et al. (36Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Google Scholar) reported values of free radical leak in the range of 0.4–0.8% for heart mitochondria respiring on physiological concentrations of succinate (less than 0.5 mm). Even if we consider our results with saturating palmitoyl carnitine (0.15 nmol of H2O2/min/mg of mitochondrial protein) for skeletal muscle mitochondria (Fig. 4), only 0.15% of electron flow gives rise to H2O2under resting conditions with a respiration rate of 200 nmol of electrons/min/mg of mitochondrial protein. This estimate of free radical leak would be lower at physiological partial pressure of oxygen, since the rate of H2O2 production by mitochondria decreases steadily with oxygen tension (22Boveris A. Chance B. Biochem. J. 1973; 134: 707-716Google Scholar). It would be even lower in more physiologically realistic conditions of subsaturating palmitoyl carnitine and lower mitochondrial membrane potential due to background ATP synthesis. Therefore, our upper estimate of free radical leak is one to two orders of magnitude lower than the frequently cited values. The results presented in this paper show that rat heart and skeletal muscle mitochondria generally display considerably higher rates of H2O2 production than liver mitochondria either in the absence or presence of inhibitors, consistent with the idea that postmitotic tissues generate more ROS through accumulation of oxidative damage (34Papa S. Skulachev V.P. Mol. Cell Biochem. 1997; 174: 305-319Google Scholar). A simpler explanation for these results is that liver mitochondria have a reduced content of mitochondrial electron transport chain components compared with heart and skeletal muscle (35Kwong L.K. Sohal R.S. Arch. Biochem. Biophys. 2000; 373: 16-22Google Scholar). Specifically, rat liver mitochondria have approximately 10 times less complex I and six times less complex III activity than heart or skeletal muscle mitochondria (35Kwong L.K. Sohal R.S. Arch. Biochem. Biophys. 2000; 373: 16-22Google Scholar). To identify the major potential sites of mitochondrial ROS production and the topology of ROS production from them, we used inhibitors of complex I and III of the electron transport chain. The inhibitors should strongly reduce different respiratory complexes and cause them to generate sufficient ROS to override the natural antioxidant systems of mitochondria. This allowed us to determine which complex has the largest capacity to generate ROS. The presence and absence of SOD permitted the identification of the topology of ROS production. We found that center o of complex III (rotenone plus succinate plus antimycin A) can generate more ROS than complex I (malate plus pyruvate plus rotenone) (Figs. 4 and 5). Center o of complex III generates superoxide (at least in part, and probably exclusively) on the cytoplasmic face of the mitochondrial inner membrane, whereas complex I produces ROS solely on the matrix side. Experiments using mitoplasts indicated that complex III can release superoxide on the cytoplasmic face of the inner membrane (18Han D. Williams E. Cadenas E. Biochem. J. 2001; 353: 411-416Google Scholar). Many studies using intact mitochondria have reported increases in H2O2production in the presence of antimycin A and rotenone (12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar, 13Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1999; 31: 347-366Google Scholar, 22Boveris A. Chance B. Biochem. J. 1973; 134: 707-716Google Scholar, 36Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Google Scholar,37Kwong L.K. Sohal R.S. Arch. Biochem. Biophys. 1998; 350: 118-126Google Scholar). However, none of these studies examined the topology of ROS production. Mitochondria respiring on complex I substrates increase their H2O2 production in the presence of myxothiazol (13Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1999; 31: 347-366Google Scholar, 36Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Google Scholar). Since the rates in the presence of rotenone in these studies are similar or higher than those in the presence of myxothiazol, it is probable that the ROS generated in the presence of myxothiazol actually originated from complex I. Finally, the possible SOD-insensitive increase in the rate of H2O2production by mitochondria supplemented with palmitoyl carnitine and myxothiazol leads us to suggest that ETF and ETF-QOR may also produce ROS on the matrix side of the inner membrane (Figs. 4 and 5). At a physiological level, our results showing very low H2O2 production by mitochondria respiring on complex I and II substrates in the absence of inhibitors fail to provide support for the conclusions that there is an inverse relationship between MLSP and H2O2 production by mitochondria from various species (4Sohal R.S. Svensson I. Brunk U.T. Mech. Ageing Dev. 1990; 53: 209-215Google Scholar) or that pigeon mitochondria respiring on complex I or II substrates generate less H2O2 than rat mitochondria (5Ku H.H. Sohal R.S. Mech. Ageing Dev. 1993; 72: 67-76Google Scholar, 6Barja G. Cadenas S. Rojas C. Perez-Campo R. Lopez-Torres M. Free Radic. Res. 1994; 21: 317-327Google Scholar, 7Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1997; 98: 95-111Google Scholar, 8Herrero A. Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 241-249Google Scholar, 30Barja G. Herrero A. J. Bioenerg. Biomembr. 1998; 30: 235-243Google Scholar). Indeed, we found that heart mitochondria from pigeons and rats respiring on malate/pyruvate did not generate measurable amounts of H2O2. In the presence of rotenone, however, rat mitochondria produced more H2O2 per mg of mitochondrial protein than did pigeon mitochondria (Fig.7 A), showing that the capacity of rat mitochondria to generate ROS is indeed higher. This was caused by a higher content of complex I in rat heart mitochondria (Fig. 7 B). The rates of ROS production per mole of complex I were not higher in rat mitochondria, suggesting that complex I from pigeon heart mitochondria does not have a decreased intrinsic capacity for ROS production. These data confirm that the maximum capacity of pigeon heart mitochondria to generate ROS from complex I is less than in rat, but fail to provide support for the theory that the elevated MLSP of pigeons compared with rats is partially due to their lower endogenous mitochondrial production of H2O2. It would be enlightening to compare mitochondrial H2O2 production between animals of different MLSP using palmitoyl carnitine. Finally, our results should not be interpreted as meaning that mitochondria produce no ROS under physiological conditions, where the major substrates will usually be pyruvate from glycolysis or long chain fatty acyl carnitines from lipid oxidation. Our results suggest that if complexes I and III of mitochondria do produce ROS physiologically during oxidation of pyruvate through the Krebs cycle, these ROS are mostly scavenged by antioxidant defense systems and little or no H2O2 escapes into the cytosol. On the other hand, fatty acid β-oxidation does lead to release of ROS, primarily from complex I on the matrix side of the inner membrane, which can lead to H2O2 spilling out into the cytosol. However, it is important to emphasize that whatever the substrate, complex I, complex III, and perhaps ETF and ETF-QOR do have the capacity to generate superoxide. A consistent small leak of electrons to oxygen that escapes the antioxidant defense systems during normal metabolism might still be sufficient to cause accumulation of oxidative damage, ultimately resulting in aging. We thank Federica Draghi and Judy Hirst for measurements of complex I concentrations and Linda Partridge for critical comments.

PGC-1α is a coactivator of nuclear receptors and other transcription factors that regulates several metabolic processes, including mitochondrial biogenesis and respiration, hepatic gluconeogenesis, and muscle fiber-type switching. We show here that, while hepatocytes lacking PGC-1α are defective in the program of hormone-stimulated gluconeogenesis, the mice have constitutively activated gluconeogenic gene expression that is completely insensitive to normal feeding controls. C/EBPβ is elevated in the livers of these mice and activates the gluconeogenic genes in a PGC-1α-independent manner. Despite having reduced mitochondrial function, PGC-1α null mice are paradoxically lean and resistant to diet-induced obesity. This is largely due to a profound hyperactivity displayed by the null animals and is associated with lesions in the striatal region of the brain that controls movement. These data illustrate a central role for PGC-1α in the control of energy metabolism but also reveal novel systemic compensatory mechanisms and pathogenic effects of impaired energy homeostasis.

mRNA translation is thought to be the most energy-consuming process in the cell. Translation and energy metabolism are dysregulated in a variety of diseases including cancer, diabetes, and heart disease. However, the mechanisms that coordinate translation and energy metabolism in mammals remain largely unknown. The mechanistic/mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) stimulates mRNA translation and other anabolic processes. We demonstrate that mTORC1 controls mitochondrial activity and biogenesis by selectively promoting translation of nucleus-encoded mitochondria-related mRNAs via inhibition of the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E)-binding proteins (4E-BPs). Stimulating the translation of nucleus-encoded mitochondria-related mRNAs engenders an increase in ATP production capacity, a required energy source for translation. These findings establish a feed-forward loop that links mRNA translation to oxidative phosphorylation, thereby providing a key mechanism linking aberrant mTOR signaling to conditions of abnormal cellular energy metabolism such as neoplasia and insulin resistance.

Recent studies have shown that genes involved in oxidative phosphorylation (OXPHOS) exhibit reduced expression in skeletal muscle of diabetic and prediabetic humans. Moreover, these changes may be mediated by the transcriptional coactivator peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1alpha (PGC-1alpha). By combining PGC-1alpha-induced genome-wide transcriptional profiles with a computational strategy to detect cis-regulatory motifs, we identified estrogen-related receptor alpha (Erralpha) and GA repeat-binding protein alpha as key transcription factors regulating the OXPHOS pathway. Interestingly, the genes encoding these two transcription factors are themselves PGC-1alpha-inducible and contain variants of both motifs near their promoters. Cellular assays confirmed that Erralpha and GA-binding protein a partner with PGC-1alpha in muscle to form a double-positive-feedback loop that drives the expression of many OXPHOS genes. By using a synthetic inhibitor of Erralpha, we demonstrated its key role in PGC-1alpha-mediated effects on gene regulation and cellular respiration. These results illustrate the dissection of gene regulatory networks in a complex mammalian system, elucidate the mechanism of PGC-1alpha action in the OXPHOS pathway, and suggest that Erralpha agonists may ameliorate insulin-resistance in individuals with type 2 diabetes mellitus.

Mitochondria play an essential role in the ability of brown fat to generate heat, and the PGC-1 coactivators control several aspects of mitochondrial biogenesis. To investigate their specific roles in brown fat cells, we generated immortal preadipocyte lines from the brown adipose tissue of mice lacking PGC-1α. We could then efficiently knockdown PGC-1β expression by shRNA expression. Loss of PGC-1α did not alter brown fat differentiation but severely reduced the induction of thermogenic genes. Cells deficient in either PGC-1α or PGC-1β coactivators showed a small decrease in the differentiation-dependant program of mitochondrial biogenesis and respiration; however, this increase in mitochondrial number and function was totally abolished during brown fat differentiation when both PGC-1α and PGC-1β were deficient. These data show that PGC-1α is essential for brown fat thermogenesis but not brown fat differentiation, and the PGC-1 coactivators play an absolutely essential but complementary function in differentiation-induced mitochondrial biogenesis.

Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator (PGC)-1alpha is a coactivator of nuclear receptors and other transcription factors that regulates several components of energy metabolism, particularly certain aspects of adaptive thermogenesis in brown fat and skeletal muscle, hepatic gluconeogenesis, and fiber type switching in skeletal muscle. PGC-1alpha has been shown to induce mitochondrial biogenesis when expressed in muscle cells, and preliminary analysis has suggested that this molecule may specifically increase the fraction of uncoupled versus coupled respiration. In this paper, we have performed detailed bioenergetic analyses of the function of PGC-1alpha and its homolog PGC-1beta in muscle cells by monitoring simultaneously oxygen consumption and membrane potential. Cells expressing PGC-1alpha or PGC-1beta display higher proton leak rates at any given membrane potential than control cells. However, cells expressing PGC-1alpha have a higher proportion of their mitochondrial respiration linked to proton leak than cells expressing PGC-1beta. Although these two proteins cause a similar increase in the expression of many mitochondrial genes, PGC-1beta preferentially induces certain genes involved in the removal of reactive oxygen species, recently recognized as activators of uncoupling proteins. Together, these data indicate that PGC-1alpha and PGC-1beta profoundly alter mitochondrial metabolism and suggest that these proteins are likely to play different physiological functions.

Metabolic reprogramming is a hallmark of cellular transformation, yet little is known about metabolic changes that accompany tumor metastasis. Here we show that primary breast cancer cells display extensive metabolic heterogeneity and engage distinct metabolic programs depending on their site of metastasis. Liver-metastatic breast cancer cells exhibit a unique metabolic program compared to bone- or lung-metastatic cells, characterized by increased conversion of glucose-derived pyruvate into lactate and a concomitant reduction in mitochondrial metabolism. Liver-metastatic cells displayed increased HIF-1α activity and expression of the HIF-1α target Pyruvate dehydrogenase kinase-1 (PDK1). Silencing HIF-1α reversed the glycolytic phenotype of liver-metastatic cells, while PDK1 was specifically required for metabolic adaptation to nutrient limitation and hypoxia. Finally, we demonstrate that PDK1 is required for efficient liver metastasis, and its expression is elevated in liver metastases from breast cancer patients. Our data implicate PDK1 as a key regulator of metabolism and metastatic potential in breast cancer.