Phosphoryl transfer is a fundamental reaction in cellular signaling and metabolism that requires Mg

Abstract Numerous challenges hinder the development of neuroprotective treatments for Parkinson's disease, with a regularly identified issue being the lack of clinically relevant animal models. Viral vector overexpression of α‐synuclein is widely considered the most relevant model; however, this has been limited by high variability and inconsistency. One potential method of optimisation is pairing it with a secondary insult such as FN075, a synthetic molecule demonstrated to accelerate α‐synucleinopathy. Thus, the aim of this study was to investigate if sequential infusion of adeno‐associated virus (AAV)‐α‐synuclein and FN075 into the rat brain can replicate α‐synucleinopathy, nigrostriatal pathology and motor dysfunction associated with Parkinson's disease. Rats received a unilateral injection of AAV‐α‐synuclein (or AAV‐green fluorescent protein) into two sites in the substantia nigra, followed 4 weeks later by unilateral injection of FN075 (or vehicle) into the striatum. Animals underwent behavioural testing every 4 weeks until sacrifice at 20 weeks, followed by immunohistochemistry assessment post‐mortem. As anticipated, AAV‐α‐synuclein led to extensive overexpression of human α‐synuclein throughout the nigrostriatal pathway, as well as elevated levels of phosphorylated and aggregated forms of the protein. However, the sequential administration of FN075 into the striatum did not exacerbate any of the α‐synuclein pathology. Furthermore, despite the extensive α‐synuclein pathology, neither administration of AAV‐α‐synuclein nor FN075, alone or in combination, was sufficient to induce dopaminergic degeneration or motor deficits. In conclusion, this approach did not replicate the key characteristics of Parkinson's disease, and further studies are required to create more representational models for testing of novel compounds and treatments for Parkinson's disease.

Abstract Cellular clearance by apoptosis is essential in life. In its intrinsic (mitochondrial) pathway apoptotic members of the Bcl-2 (B cell CLL/lymphoma-2) protein family, such as Bax (Bcl-2-associated X) protein, perforate the mitochondrial outer membrane (MOM), which causes release of apoptotic factors and final cell death. How those apoptotic proteins mechanistically exert their action at the membrane level still however remains elusive. Upon internal stress signals Bax is massively recruited to the MOM, where it oligomerizes and partially penetrates into the membrane. Using neutron reflectometry (NR) and attenuated total reflection Fourier-Transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) spectroscopy we unraveled key molecular steps of this membrane-affiliation process of Bax on a spatial and temporal scale. By titrating intact human Bax to MOM-like bilayers containing cardiolipin, essential for protein recruitment, we could identify different functional phases. Initially, there is a fast adsorption event to the membrane surface with high affinity. Thereafter, a kinetically slower (minutes to hours) event occurs with Bax penetration, thereby triggering a major reorganizing of the mitochondrial bilayer. Finally, a membrane-Bax complex is generated, with a minor Bax population remaining membrane-inserted, while the main population is relocated to the membrane surface upon lipid redistribution into a complex with Bax; a process enabling membrane perforation. We propose a comprehensive molecular model of mitochondrial membrane penetration by formation of complex Bax/lipid clusters; a concept which provides a new foundation to understand the cell-killing activity of Bax and its apoptotic relatives in human cells. Significance Statement The apoptotic Bax protein is a key player in the mitochondrial apoptotic pathway. Here, neutron reflectometry (NR) unravels the mechanism by which Bax is targeting and perforating mitochondria to release apoptotic factors for final cell death. We found that this cardiolipin driven process of the outer mitochondrial membrane system has two main phases. Upon a fast (10-20 min) phase of membrane association Bax initiates the formation of pores by removing lipids and depositing them as Bax/lipid complexes on top of the bilayer on a time scale of several hours similar to in vivo apoptotic cell death. Our results provide a mechanistic rationale for cell-killing processes driven by apoptotic Bcl-2 proteins; and their molecular inhibition in many cancers.

Abstract Many pathogenic bacteria produce protein toxins that target and perturb host cell membranes. The secreted α-pore-forming toxins (α-PFTs) cause membrane damage via pore formation. This study demonstrates a remarkable, hitherto unknown mechanism by an α-PFT protein from Vibrio cholerae . As part of the MakA/B/E tripartite toxin, MakA is involved in membrane pore formation similar to other α-PFTs. In contrast, MakA protein alone induces tube-like structures in the acidic lysosomal host cell compartment. In vitro studies unravel the dynamics of tubular growth, which occur in a pH-, lipid- and concentration-dependent manner. A 3.7-Å cryo-electron microscopy structure of MakA filaments reveals a unique protein-lipid superstructure. In its active α-PFT conformation, MakA embeds its transmembrane helices into a thin annular lipid bilayer and spirals around a central cavity. Our study provides molecular insights into a novel tubulation mechanism of an α-PFT protein, revealing a new mode of action by a secreted bacterial toxin.