Muscle biomechanics is determined by active motor-protein assembly and passive strain transmission through cytoskeletal structures. The desmin filament network aligns myofibrils at the z-discs, provides nuclear-sarcolemmal anchorage and serves as structural muscle memory. Previous analyses of our R349P desmin knock-in mouse model depicted pre-clinical changes in myofibrillar arrangement and increased fiber bundle stiffness. Since the effect of R349P desmin on axial biomechanics in muscle fibers is unknown, we used our MyoRobot to study biomechanics changes in single fibers during aging and across genotypes. We demonstrate that R349P desmin increases axial stiffness in fast- and slow-twitch muscle fibers and promotes a pre-aged phenotype. No systematic changes in Ca2+-mediated force were found. Mutant fibers showed faster unloaded shortening kinetics. Effects of ageing seen in the wild-type appeared earlier in mutant desmin fibers. Impaired R349P desmin muscle biomechanics is clearly an effect of a compromised intermediate filament network rather than secondary to fibrosis.

Abstract Desminopathies comprise hereditary myopathies and cardiomyopathies caused by mutations in the intermediate filament protein desmin that lead to severe and often lethal degeneration of striated muscle tissue. Animal and single cell studies hinted that this degeneration process is associated with massive ultrastructural defects correlating with increased susceptibility of the muscle to acute mechanical stress. The underlying mechanism of mechanical susceptibility, and how muscle degeneration develops over time, however, has remained elusive. Here, we investigated the effect of a desmin mutation on the formation, differentiation, and contractile function of in vitro -engineered three-dimensional micro-tissues grown from muscle stem cells (satellite cells) isolated from heterozygous R349P desmin knock-in mice. Micro-tissues grown from desmin-mutated cells exhibited spontaneous unsynchronized contractions, higher contractile forces in response to electrical stimulation, and faster force recovery compared to tissues grown from wild-type cells. Within one week of culture, the majority of R349P desmin-mutated tissues disintegrated, whereas wild-type tissues remained intact over at least three weeks. Moreover, under tetanic stimulation lasting less than five seconds, desmin-mutated tissues partially or completely ruptured, whereas wild-type tissues did not display signs of damage. Our results demonstrate that the progressive degeneration of desmin-mutated micro-tissues is closely linked to extracellular matrix fiber breakage associated with increased contractile forces and unevenly distributed tensile stress. This suggests that the age-related degeneration of skeletal and cardiac muscle in patients suffering from desminopathies may be similarly exacerbated by mechanical damage from high-intensity muscle contractions. We conclude that micro-tissues may provide a valuable tool for studying the organization of myocytes and the pathogenic mechanisms of myopathies.

ABSTRACT Background A common polymorphism (R577X) in the ACTN3 gene results in complete absence of the Z-disc protein α-actinin-3 from fast-twitch muscle fibres in ~16% of the world’s population. This single gene polymorphism has been subject to strong positive selection pressure during recent human evolution. Previously, using an Actn3KO mouse model, we have shown in fast-twitch muscles, eccentric contractions at L 0 + 20% stretch did not cause eccentric damage. In contrast, L 0 + 30% stretch produced a significant ~40% deficit in maximum force; here we use isolated single fast-twitch skeletal muscle fibres from the Actn3KO mouse to investigate the mechanism underlying this. Methods Single fast-twitch fibres are separated from the intact muscle by a collagenase digest procedure. We use label-free second harmonic generation (SHG) imaging, ultra-fast video microscopy and skinned fibre measurements from our MyoRobot automated biomechatronics system to study the morphology, visco-elasticity, force production and mechanical strength of single fibres from the Actn3KO mouse. Data are presented as means ± SD and tested for significance using ANOVA. Results We show that the absence of α-actinin-3 does not affect the unloaded maximum speed of contraction, visco-elastic properties or myofibrillar force production. Eccentric contractions demonstrated that chemically skinned Actn3KO fibres are mechanically weaker being prone to breakage when eccentrically contracted. Furthermore, SHG images reveal disruptions in the myofibrillar alignment of Actn3KO fast-twitch fibres with an increase in Y-shaped myofibrillar lattice shifts. Conclusions Absence of α-actinin-3 from the Z-disc in fast-twitch fibres disrupts the organisation of the myofibrillar proteins, leading to structural weakness. This provides a mechanistic explanation for our earlier findings that, in vitro intact Actn3KO fast-twitch muscles are significantly damaged by L 0 + 30%, but not, L 0 + 20%, eccentric contraction strains. Our study also provides a possible mechanistic explanation as to why α-actinin-3 deficient humans have been reported to have a faster decline in muscle function with increasing age, that is; as sarcopenia reduces muscle mass and force output, the eccentric stress on the remaining functional α-actinin-3 deficient fibres will be increased, resulting in fibres breakages.