Abstract Photosynthetic organisms like plants, algae, and cyanobacteria use light for the regeneration of dihydronicotinamide dinucleotide phosphate (NADPH). The process starts with the light-driven oxidation of water by photosystem II (PSII) and the released electrons are transferred via the cytochrome b 6 f complex towards photosystem I (PSI). This membrane protein complex is responsible for the light-driven reduction of the soluble electron mediator ferredoxin (Fd), which passes the electrons to ferredoxin NADP + reductase (FNR). Finally, NADPH is regenerated by FNR at the end of the electron transfer chain. In this study, we established a clickable fusion system for in vitro NADPH regeneration with PSI-Fd and PSI-Fd-FNR, respectively. For this, we fused immunity protein 7 (Im7) to the C-terminus of the PSI-PsaE subunit in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Furthermore, colicin DNase E7 (E7) fusion chimeras of Fd and FNR with varying linker domains were expressed in E. coli . Isolated Im7-PSI was coupled with the E7-Fd or E7-Fd-FNR fusion proteins through high-affinity binding of the E7/Im7 protein pair. The corresponding complexes were tested for NADPH regeneration capacity in comparison to the free protein systems demonstrating the general applicability of the strategy.

Fixation of CO 2 into the organic compound formate by formate dehydrogenases (FDHs) is regarded as the oldest autotrophic process on Earth. It has been proposed that an FDH-dependent CO 2 fixation module could support CO 2 assimilation even in photoautotrophic organisms. In the present study, we characterized FDH from Clostridium carboxidivorans ( cc FDH) due to its ability to reduce CO 2 under aerobic conditions. During the production of recombinant cc FDH, in which the selenocysteine codon was replaced by Cys, we were able to replace the W with Mo as the transition metal in the cc FDH metal cofactor, resulting in a two-fold increase of 6 μmol formate min −1 in enzyme activity. Then, we generated cc FDH variants in which the strict NADH preference of the enzyme was changed to NADPH, as this reducing agent is produced in high amounts during the photosynthetic light process. Finally, we showed that the native cc FDH can also directly use ferredoxin as a reducing agent, which is produced by the photosynthetic light reactions at photosystem I. These data collectively suggest that cc FDH and, particularly, its optimized variants can be regarded as suitable enzymes to couple formate production to photosynthesis in photoautotroph organisms, which could potentially support CO 2 assimilation via the Calvin–Benson–Bassham (CBB) cycle and minimize CO 2 losses due to photorespiration.