Recent evidence suggests that capillary pericytes are contractile and play a crucial role in the regulation of microcirculation. However, failure to detect components of the contractile apparatus in capillary pericytes, most notably α-smooth muscle actin (α-SMA), has questioned these findings. Using strategies that allow rapid filamentous-actin (F-actin) fixation (i.e. snap freeze fixation with methanol at −20°C) or prevent F-actin depolymerization (i.e. with F-actin stabilizing agents), we demonstrate that pericytes on mouse retinal capillaries, including those in intermediate and deeper plexus, express α-SMA. Junctional pericytes were more frequently α-SMA-positive relative to pericytes on linear capillary segments. Intravitreal administration of short interfering RNA (α-SMA-siRNA) suppressed α-SMA expression preferentially in high order branch capillary pericytes, confirming the existence of a smaller pool of α-SMA in distal capillary pericytes that is quickly lost by depolymerization. We conclude that capillary pericytes do express α-SMA, which rapidly depolymerizes during tissue fixation thus evading detection by immunolabeling.

Tissue light scatter impedes the detailed visualization of deep microvascular networks inside the living mammal. The transparency of the mammalian eye, however, provides a unique opportunity to study the microvessels of the retina, a part of the central nervous system. Yet despite its clarity, imperfections in the optics of the eye blur microscopic retinal capillaries, and single blood cells flowing within. This limits evaluation of microvascular diseases that originate in capillaries. To break this barrier, we use adaptive optics to noninvasively measure single–cell blood flow, in one of the most widely used research animals: the C57BL/6J mouse. Flow ranged four orders of magnitude (0.0002–1.55 μL min−1) across the full spectrum of retinal vessel diameters (3.2–45.8 μm), without requiring surgery or contrast dye. Here we describe the data collection approach using adaptive optics and provide an analysis pipeline that can measure millions of blood cell speeds automatically.

Insight into the immune status of the living eye is essential as we seek to understand ocular disease and develop new treatments. The nonhuman primate (NHP) is the gold standard preclinical model for therapeutic development in ophthalmology, owing to the similar visual system and immune landscape in the NHP relative to the human. Here, we demonstrate the utility of phase-contrast adaptive optics scanning light ophthalmoscope (AOSLO) to visualize immune cell dynamics on the cellular scale, label-free in the NHP.

Abstract In response to central nervous system (CNS) injury, tissue resident immune cells such as microglia and circulating systemic neutrophils are often first responders. The degree to which these cells interact in response to CNS damage is poorly understood, and even less so, in the neural retina which poses a challenge for high resolution imaging in vivo. In this study, we deploy fluorescence adaptive optics scanning light ophthalmoscopy (AOSLO) to study fluorescent microglia and neutrophils in mice. We simultaneously track immune cell dynamics using label-free phase-contrast AOSLO at micron-level resolution. Retinal lesions were induced with 488 nm light focused onto photoreceptor (PR) outer segments. These lesions focally ablated PRs, with minimal collateral damage to cells above and below the plane of focus. We used in vivo (AOSLO, SLO and OCT) imaging to reveal the natural history of the microglial and neutrophil response from minutes-to-months after injury. While microglia showed dynamic and progressive immune response with cells migrating into the injury locus within 1-day after injury, neutrophils were not recruited despite close proximity to vessels carrying neutrophils only microns away. Post-mortem confocal microscopy confirmed in vivo findings. This work illustrates that microglial activation does not recruit neutrophils in response to acute, focal loss of photoreceptors, a condition encountered in many retinal diseases.

Abstract Our recent work characterized the movement of single blood cells within the retinal vasculature of healthy mice (Joseph et al. 2019) using adaptive optics ophthalmoscopy. Here we apply this technique to the context of acute inflammation and discover both infiltrating and tissue-resident immune cells to be visible without any labelling in the living retina using near - infrared light alone. Intravital imaging of immune cells can be negatively impacted by surgical manipulation, exogenous dyes, transgenic manipulation and phototoxicity. These confounds are now overcome, using phase contrast and time-lapse videography to reveal the dynamic behavior of myeloid cells as they interact, extravasate and survey the retina. Cellular motility and differential vascular responses can be measured noninvasively and in vivo across hours to months at the same retinal location, from initiation to the resolution of inflammation. As comparable systems are already available for clinical research, this approach could be readily translated to human application. Impact statement Immune cell motility and vascular response are imaged in vivo and label-free in the CNS for the first time, using high-resolution phase-contrast adaptive optics retinal imaging.

Purpose: Mice are highly used in retinal research because, like humans, mice have vascularized retinas and choroidal circulation. Although the retinal circulation has been well-characterized in development, its stability during adulthood is less understood. To examine this network, we quantified several key metrics of the trilaminar vasculature. Methods: We used mice (n = 15) with transgenic fluorescent NG2-DsRed (JX: #00824), a vascular-associated label in the retina. One eye per mouse was imaged using confocal microscopy (Nikon A1 Ti2 Eclipse) and traced with ImageJ SNT tools. Using an adaptive optics scanning light ophthalmoscope, additional mice (n = 3) were imaged at single-cell resolution within the living eye to measure the same vasculature. Results: Across mice, we found a stable retinal circulation that formed and maintained a trilaminar stratification throughout early adulthood at all eccentricities. Bridging these layers, microvessels had five distinct anatomical branching patterns. The superficial, intermediate, and deep plexuses increased in density with depth: 16.14 ± 3.61 mm/mm2, 22.14 ± 6.86 mm/mm2, and 31.01 ± 6.24 mm/mm2, respectively. This patterning was not impacted by eccentricity or age (13–61 weeks). Similar metrics were achieved using adaptive optics scanning light ophthalmoscope in vivo with the same analysis pipeline. Conclusions: The mouse retinal vasculature was stable up to 50 weeks of age, providing a robust and extensive baseline dataset with which models of retinal vascular and neural disease may be compared. Vessels connecting the laminae were more complex than previously reported and represented a uniquely vulnerable population due to their relatively low density.