The ability to prevent blood loss in response to injury is a critical, evolutionarily conserved function of all vertebrates. Prothrombin (F2) contributes to both primary and secondary hemostasis through the activation of platelets and the conversion of soluble fibrinogen to insoluble fibrin, respectively. Complete prothrombin deficiency has never been observed in humans and is incompatible with life in mice, limiting the ability to understand the entirety of prothrombin's in vivo functions. We have previously demonstrated the ability of zebrafish to tolerate loss of both pro- and anticoagulant factors that are embryonic lethal in mammals, making them an ideal model for the study of prothrombin deficiency. Using genome editing with TALENs, we have generated a null allele in zebrafish f2. Homozygous mutant embryos develop normally into early adulthood, but demonstrate eventual complete mortality with the majority of fish succumbing to internal hemorrhage by 2 months of age. We show that despite the extended survival, the mutants are unable to form occlusive thrombi in both the venous and arterial systems as early as 3-5 days of life, and we were able to phenocopy this early hemostatic defect using direct oral anticoagulants. When the equivalent mutation was engineered into the homologous residues of human prothrombin, there were severe reductions in secretion and activation, suggesting a possible role for kringle 1 in thrombin maturation, and the possibility that the F1.2 fragment has a functional role in exerting the procoagulant effects of thrombin. Together, our data demonstrate the conserved function of thrombin in zebrafish, as well as the requirement for kringle 1 for biosynthesis and activation by prothrombinase. Understanding how zebrafish are able to develop normally and survive into early adulthood without prothrombin will provide important insight into its pleiotropic functions as well as the management of patients with bleeding disorders.

Venous thrombosis is a leading cause of morbidity/mortality and associated with deficiencies of the anticoagulant protein C (PC, PROC) and its cofactor, protein S (PS, PROS1). Heterozygous mutations increase the risk of adult-onset thrombosis, while homozygous mutations result in pre/neonatal lethal thrombosis. PC- and PS-deficient patient phenotypes are generally considered clinically indistinguishable. Here we generate proc (zebrafish PROC ortholog) and pros1 knockouts through genome editing in zebrafish and uncover partially discordant phenotypes. proc-/- mutants exhibited ~70% lethality at one year of age, while pros1-/- survival was unaffected. Induced venous endothelial injury in both mutants revealed reduced occlusive thrombus formation. This is consistent with the consumptive coagulopathy of zebrafish antithrombin (at3) knockouts, which also results in spontaneous venous thrombosis. However, proc and pros1 mutants revealed a discrepancy. Although both mutants demonstrated spontaneous thrombosis, proc-/- was localized to the cardiac and venous systems, while pros1-/- was intracardiac. Aside from coagulation, PC has been shown to have PS-independent roles in inflammation. proc mutants displayed altered inflammatory markers and defects in neutrophil migration independent of pros1. Transcriptomic analysis and gene knockdown identified novel proc genetic interactions with adgrf7, a GPCR not previously known to be involved in coagulation. In summary, our data reveal differences between PC- and PS-deficient thrombosis, with cardiovascular tissue-specific phenotypes and survival differences, suggesting the possibility of underlying clinical differences in affected patients. This model of complete proc-/- deficiency in an accessible organism will facilitate further in vivo study of these distinctions, as well as PS-dependent and independent functions of PC.