Abstract BACKGROUND Histone mutations (H3 K27M, H3 G34R/V) define subtypes of paediatric-type diffuse high-grade gliomas (HGG) (diffuse midline glioma (DMG), H3 K27-altered, diffuse hemispheric glioma (DHG), H3 G34-mutant). The WHO classification recognises exceptional cases where these mutations co-occur. We report one such case of a 2-year-old female presenting with neurological symptoms and lethargy. METHODS MRI imaging identified a brainstem lesion; a stereotactic needle biopsy was undertaken, followed by standard diagnostic neuropathology workflows including histology review, panel immunohistochemistry, DNA methylation profiling (Illumina EPIC BeadArrays, brain tumour classifier (MNP v12.5 R package)) and WES/WGS. Patient-derived in vitro cell cultures were established allowing further characterisation using RNAseq and chromatin immunoprecipitation assays with sequencing (ChIP-seq). RESULTS Histology showed diffusely infiltrating pleomorphic astrocytes, multinucleated cells, and conspicuous mitotic activity; the diagnosis was DMG, H3 K27-altered (immunohistochemistry: H3K27me3 loss, H3K27M positivity). DNA methylation profiling classified the tumour as ‘DMG, H3 K27-altered’ (calibrated score=0.99). WES/WGS revealed concurrent H3.1 K27M and G34R mutations (clonal, in the same reads) of HIST1H3C (H3C3), somatic variants in FGF11 and PIK3CA, and a pathogenic germline NBN variant. The RNAseq profile of the primary tumour and cell cultures clustered with H3 K27M-mutant tumours. Unbiased in vitro drug screening showed no selective sensitivities. ChIP-seq (H3K27ac, H3K27me3, H3K36me3, RNApol2 marks) showed features in keeping with DMG H3 K27M-mutant tumours (H3K27ac loci including OLIG2, IRX1/2, PKDCC). The patient was treated with adjuvant radiotherapy and everolimus, but progressed and passed away 13 months post-diagnosis. CONCLUSION This case is an exceptionally rare, complex variant of histone-mutant paediatric HGG, and the first reported occurrence in HIST1H3C (H3C3). It illustrates that in cis, the H3.1 K27M mutation demonstrates a dominance over molecular and clinical profiles compared to G34R, and highlights the importance of broad molecular profiling to identify such examples for further study.

Non-invasive prenatal testing (NIPT) to date is used in the clinic primarily to detect foetal aneuploidy. Few studies so far have focused on the detection of monogenic autosomal recessive disorders where mother and foetus carry the same mutation. In particular, NIPT is currently not available for the detection of Sickle Cell Anaemia (SCA), the most common monogenic disorder world-wide and the most common indication for invasive prenatal testing in high-income countries. Here, we report the clinical validation of a novel diagnostic approach that combines ultra-sensitive amplicon-based sequencing of cell-free DNA (cfDNA) with internal controls and bias factor correction to calculate the probability for the presence of allelic imbalance from maternal plasma without prior knowledge of the paternal genotype. Identification of the foetal genotype was determined using a hierarchical probabilistic model based on the relative number of reads from the sequencing, along with the foetal fraction. NIPT was performed on a cohort of 57 patients, all of whom had previously undergone invasive prenatal testing so that the foetal genotype was known. Overall, NIPT demonstrated 100% sensitivity and negative predictive value for foetal fractions higher than 0.5%, and 100% specificity and positive predictive value for foetal fractions higher than or equal to 4%. Our methodology can be used as a safe, non-invasive screening tool in any clinical scenarios where early prenatal diagnosis of SCA or other recessive disorders is important.

The spleen is prone to both physical damage and functional impairment, which can be difficult to detect before catastrophic complications occur. Currently available tests of splenic function are laborious, user-dependent and unreliable, so there is an unmet need for a reliable test offered routinely in diagnostic laboratories. In this study, we have assessed a simple flow cytometry-based method measuring high mannose glycans (HMGs) on erythrocytes, which has previously been proposed as a potential test of splenic function. We developed the test as a diagnostic assay using blood from a range of control and potentially hyposplenic samples, including people with sickle cell disease. HMG expression correlated well with manual pit counting, an established method for assessing splenic function (r = 0.6). A threshold of >36% difference compared to the mean of control samples was used to define hyposplenism. At this threshold, the test is 93% sensitive and 100% specific for detecting splenic dysfunction. The test was highly reproducible and stable in blood samples of up to 4 days old. This test is non-invasive with quantitative data output and requires significantly less operator time than other available techniques, making it a robust new clinical assay for determining splenic function.