Achievement of immunocompetent and therapeutic T lymphopoiesis from pluripotent stem cells is a central aim in T cell regenerative medicine. To date, preferentially regenerating T lymphopoiesis in vivo from pluripotent stem cells (PSC) remains a practical challenge. Here we documented that synergistic and transient expression of Runx1 and Hoxa9 restricted in the time window of endothelial to hematopoietic transition and hematopoietic maturation stages induced in vitro from PSC (iR9-PSC) preferentially generated engraftable hematopoietic progenitors capable of homing to thymus and developing into mature T (iT) cells in primary and secondary immunodeficient recipients. Single-cell transcriptome and functional analyses illustrated the cellular trajectory of T lineage induction from PSC, unveiling the T-lineage specification determined at as early as hemogenic endothelial cell stage and identifying the bona fide pre-thymic progenitors. The iT cells distributed normally in central and peripheral lymphoid organs and exhibited abundant TCRαβ repertoire. The regenerative T lymphopoiesis rescued the immune-surveillance ability in immunodeficient mice. Furthermore, gene-edited iR9-PSC produced tumor-specific-T cells in vivo that effectively eradicated tumor cells. This study provides insight into universal generation of functional and therapeutic T lymphopoiesis from the unlimited and editable PSC source.

Bone marrow (BM) mesenchymal stem cells (MSCs) are critical components of the BM microenvironment and play an essential role in supporting hematopoiesis. Dysfunction of MSCs is associated with the impaired BM microenvironment that promotes leukemia development. However, whether and how restoration of the impaired BM microenvironment can inhibit leukemia development remain unknown. Using an established leukemia model and the RNA-seq analysis, we discovered functional degeneration of MSCs during leukemia progression. Importantly, intra-BM instead of systemic transfusion of donor healthy MSCs restored the BM microenvironment, thus systemically altering cytokine expression patterns, improving normal hematopoiesis, reducing tumor burden, and ultimately prolonging survival of the leukemia-bearing mice. Donor MSC treatment restored the function of host MSCs and reprogrammed host macrophages to fulfill tissue-repair function. Transfusion of MSC-reprogrammed macrophages largely recapitulated the therapeutic effects of MSCs. Further, we found that donor MSCs reprogrammed macrophages to reduce leukemia burden through autocrine of IL-6. Taken together, our study reveals that donor MSCs reprogram host macrophages to restore the BM microenvironment and inhibit leukemia development, thus offering rationales for local MSC administration as a potentially effective therapy for leukemia.Key Points Key Point 1 : Intra-BM transfusion of MSCs restores the BM microenvironment, improves thrombopoiesis, and suppresses MDS/MPN initiated by Nras mutation.Key Point 2 : Donor MSCs reprogram macrophages to restore the BM microenvironment, improve thrombopoiesis, and suppress leukemia.

Abstract Hematopoietic stem cells (HSCs) are dominantly quiescent under homeostasis, which is a key mechanism of maintaining the HSC pool for life-long hematopoiesis. Dormant HSCs poise to be immediately activated on urgent conditions and can return to quiescence after regaining homeostasis. To date, the molecular networks of regulating the threshold of HSC dormancy, if exist, remain largely unknown. Here, we unveiled that deletion of Nupr1 , a gene preferentially expressed in HSCs, activated the quiescence HSCs under homeostatic status, which conferred engraftment competitive advantage on HSCs without compromising their stemness and multi-lineage differentiation abilities in serial transplantation settings. Following an expansion protocol, the Nupr1 -/- HSCs proliferate more robustly than their wild type counterparts in vitro. Nupr1 inhibits the expression of p53 and the rescue of which offsets the engraftment advantage. Our data unveil the de novo role of Nupr1 as an HSC quiescence-regulator, which provides insights into accelerating the engraftment efficacy of HSC transplantation by targeting the HSC quiescence-controlling network.

Abstract Chimeric antigen receptor (CAR) natural killer cells (CAR NK) cells, leveraging safety and not requiring HLA match in adoptive infusion, have emerged as promising alternative cells to CAR-T cells for immunotherapies. High and multiple doses of CAR NK cell infusions are essential to maintain therapeutic efficacy in clinical trials. This requires efficient methods for generating large-scale CAR NK cells and significantly reducing CAR engineering costs. In this study, we develop a three-step strategy to generate highly high yields of induced NK (iNK) and CAR iNK cells from human umbilical cord blood CD34 + hematopoietic stem and progenitor cells (CD34 + HSPCs). Starting from a single umbilical cord blood CD34 + HSPC, our reliable method efficiently produces 14-83 million mature iNK cells or 7-32 million CAR iNK cells with high expression levels of CD16 and zero T cell contaminations. Introducing CAR expression elements at the HSPC level reduces the quantities of CAR pseudoviruses to 1 / 140.000 - 1 / 600,000 compared to engineering CARs in mature NK cells. The iNK and CAR iNK cells, including fresh cells and thawed cells from cryopreserved conditions, demonstrate remarkable tumoricidal activities against various human cancer cells and significantly prolong the survival of human tumor-bearing animals. The high yields of CAR NK cells and negligible costs of CAR engineering of our method support the broad applications of CAR NK cells for treating cancer patients.

SUMMARY Regeneration of humoral immunity from pluripotent stem cells (PSCs) is a crucial aim in translational medicine. However, reconstitution of complete, sustained, and functional B lymphopoiesis from PSCs has not yet been developed. Here, we successfully achieved regenerative B lymphopoiesis in B-cell deficient animals transplanted with PSC-derived hematopoietic progenitors (iHPCs) guided by synergistic expression of Runx1, Hoxa9 , and Lhx2 . Upon transplantation, the iHPCs immediately gave rise to pro/pre-B cells in recipients’ bone marrow, which were able to further differentiate into the entire B cell lineages, including innate B-1a, B-1b, MZ B cells, as well as adaptive FO B cells. In responding to antigen stimuli, the regenerative B cells produced adaptive humoral immune responses, sustained a prolonged antigen-specific antibody production, and formed immune-memory. Particularly, the regenerative B cells in spleen showed developing patterns of immunoglobulin chain-switch and hyper-mutation via a cross-talk with the host T follicular helper cells, which eventually formed T cell-dependent humoral responses. This study provides de novo evidence that B lymphopoiesis can be regenerated from PSCs via a HSC-independent approach, which provides insights into treating B-cell related humoral deficiencies using PSCs as unlimited cell resource.

ABSTRACT Human pluripotent stem cell (hPSC)-induced NK (iNK) cells are a promising “off-the-shelf” cell product for universal immune therapy. Conventional methods for iNK cell regeneration from hPSCs include embryonic body-formation and feeder-based expansion steps, which bring instability, time-consuming, and high costs for manufacture. In this study, we develop an embryonic body-free, organoid aggregate method for NK cell regeneration from hPSCs. In a short time window of 27-day induction, millions of hPSC input can produce over billions of iNK cells without the necessity of NK cell-expansion feeders. The iNK cells highly express classical toxic granule proteins, apoptosis-inducing ligands, as well as abundant activating and inhibitory receptors. Functionally, the iNK cells eradicate human tumor cells by mechanisms of direct cytotoxity, apoptosis, and antibody-dependent cellular cytotoxicity. This study provides a reliable scale-up method for regenerating human NK cells from hPSCs, which promotes the universal availability of NK cell products for immune therapy.

Abstract The expression of transcription factor Hoxb5 specifically marks the functional hematopoietic stem cells (HSC) in mice. However, our recent work demonstrated that ectopic expression of Hoxb5 exerted little effect on HSC but could convert B cell progenitors into functional T cells in vivo. Thus, cell type- and development stage-specific roles of Hoxb5 in hematopoietic hierarchy await more extensive exploration. Here, with a mouse strain engineered with conditional expression of Hoxb5, we unveiled that induced expression of Hoxb5 in mouse multipotent progenitor cells (MPP) led to the generation of a de novo Sca1 + cKit + Mac1 + CD48 + (Mac1 + CD48 + SK) cell type, which has the ability to repopulate long-term multi-lineage hematopoiesis in serial transplant recipients. RNA-seq analyses showed that Mac1 + CD48 + SK cells exhibited an acquired machinery of DNA replication and cell division, which resembled nature fetal liver HSC cells (FL HSC). In short, our current study uncovers that Hoxb5 is able to empower MPP with self-renewal potential, thereby providing new strategies to reprogram blood progenitor cells into HSC-like cells.