The effect of the plant alkaloid ryanodine on the skeletal muscle sarcoplasmic reticulum Ca2+ release channel was studied by determining the Ca2+ permeability of heavy vesicles passively loaded with 45Ca2+ in the presence or absence of ryanodine. Depending on the experimental conditions, ryanodine either stimulated or inhibited Ca2+ efflux. Vesicles were rendered permeable to 45Ca2+ at a ryanodine concentration of 0.01 microM when diluted into a medium containing the two Ca2+ release channel inhibitors Mg2+ and ruthenium red. At ryanodine concentrations greater than 10 microM, 45Ca2+ efflux was inhibited in channel-activating (5 microM Ca2+) or -inhibiting (10 mM Mg2+ plus 10 microM ruthenium red) media. An optimal stimulatory effect was observed when vesicles were incubated with ryanodine at 37 degrees C and in media that caused partial opening of the channel. Similar results to those described above were obtained using cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles that were capable of rapid 45Ca2+ efflux. Use of the slowly permeating molecule L-[3H]glucose allowed measurement of channel-mediated efflux rates from vesicles in the presence and absence of ryanodine. At low activating concentrations, ryanodine did not appreciably change the regulation of L-glucose efflux rates by external Ca2+, Mg2+, and adenine nucleotide. These results suggested two possible modes of action of ryanodine: 1) a change in the gating mechanism of the channel which is not readily detected using the slowly permeating molecule L-glucose or 2) a change in channel structure which prevents its complete closing.

We have cloned cDNAs encoding the rabbit and human forms of the Ca2+ release channel of sarcoplasmic reticulum. The human cDNA encodes a protein of 5032 amino acids, with a molecular weight of 563,584, which is made without an NH2-terminal signal sequence. Amino acid substitutions between rabbit and human sequences were noted in 163 positions and deletions or insertions in eight regions accounted for additional sequence differences between the two proteins. Analysis of the sequence indicates that 10 potential transmembrane sequences in the COOH-terminal fifth of the molecule and two additional, potential transmembrane sequences nearer to the center of the molecule could contribute to the formation of the Ca2+ conducting pore. The remainder of the molecule is hydrophilic and presumably constitutes the cytoplasmic domain of the protein. A 114-120 amino acid motif is repeated four times in the protein, in residues 841-954, 955-1068, 2725-2844, and 2845-2958 and a 16 amino acid part of the motif is repeated twice more in residues 1344-1359 and 1371-1386. Although the channel is modulated by Ca2+, ATP, and calmodulin, no clear high affinity Ca2(+)-binding domain of the EF hand type and no clear high affinity ATP-binding domain were detected in the primary sequence. An acidic sequence in residues 1872-1923 contains 79% glutamate or aspartate residues and this sequence is a potential low affinity Ca2(+)-binding site. Several potential calmodulin-binding sites were observed in the sequence, in the region 2800 to 3050.

Cardiovascular disease is the leading cause of human morbidity and mortality. Dilated cardiomyopathy (DCM) is the most common form of cardiomyopathy associated with heart failure. Here, we report that cardiac-specific knockout of Dicer, a gene encoding a RNase III endonuclease essential for microRNA (miRNA) processing, leads to rapidly progressive DCM, heart failure, and postnatal lethality. Dicer mutant mice show misexpression of cardiac contractile proteins and profound sarcomere disarray. Functional analyses indicate significantly reduced heart rates and decreased fractional shortening of Dicer mutant hearts. Consistent with the role of Dicer in animal hearts, Dicer expression was decreased in end-stage human DCM and failing hearts and, most importantly, a significant increase of Dicer expression was observed in those hearts after left ventricle assist devices were inserted to improve cardiac function. Together, our studies demonstrate essential roles for Dicer in cardiac contraction and indicate that miRNAs play critical roles in normal cardiac function and under pathological conditions.

Ryanodine affects excitation-contraction coupling in skeletal and cardiac muscle by specifically interacting with the sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ release channel. The effect of the drug at the single channel level was studied by incorporating skeletal and cardiac SR vesicles into planar lipid bilayers. The two channels were activated by micromolar free Ca2+ and millimolar ATP and inhibited by Mg2+ and ruthenium red. Addition of micromolar concentrations of ryanodine decreased about twofold the unit conductance of the Ca2+- and ATP-activated skeletal and cardiac channels. A second effect of ryanodine was to increase the open probability (Po) of the channels in such a way that Po was close to unity under a variety of activating and inactivating conditions. The effects of ryanodine were long lasting in that removal of ryanodine by perfusion did not return the channels into their fully conducting state.

A subpopulation of canine cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles has been found to contain a "Ca2+ release channel'' which mediates the release of intravesicular Ca2+ stores with rates sufficiently rapid to contribute to excitation-contraction coupling in cardiac muscle.45Ca2+ release behavior of passively and actively loaded vesicles was determined by Millipore filtration and with the use of a rapid quench apparatus using the two Ca2+ channel inhibitors, Mg2+ and ruthenium red.At pH 7.0 and 5-20 PM external Ca2+, cardiac vesicles released half of their 45Ca2+ stores within 20 ms.Ca2+-induced Ca2+ release was inhibited by raising and lowering external Ca2+ concentration, by the addition of Mg2+, and by decreasing the pH.Calmodulin reduced the Ca2+-induced Ca2+ release rate 3-6-fold in a reaction that did not appear to involve a calmodulindependent protein kinase.Under various experimental conditions, ATP or the nonhydrolyzable ATP analog, adenosine 5'-(B,y-methylene)triphosphate (AMP-PCP), and caffeine stimulated 4SCa2+ release 2-500fold.Maximal release rates (tU = 10 ms) were observed in media containing 10 PM Ca2+ and 5 m M AMP-PCP or 10 mM caffeine.An increased external Caz+ concentration (21 mM) was required to optimize the 45Ca2+ efflux rate in the presence of 8 m M Mg2+ and 5 m M AMP-PCP.These results suggest that cardiac sarcoplasmic reticulum contains a ligand-gated Ca2+ channel which is activated by Ca2+, adenine nucleotide, and caffeine, and inhibited by Mg2+, H', and calmodulin.Sarcoplasmic reticulum (SR)' plays an important role in the regulation of muscle contraction and relaxation by rapidly releasing and sequestering Ca2+ (for reviews, see Refs.1-5).Physiological release of Ca2+ from SR is triggered by an action potential that is thought to be communicated to SR where the junctional areas of SR become closely apposed to the surface membrane.How a surface membrane action potential induces release of Ca2+ from SR is not well understood.One hypothesis, which is supported by studies with skinned cardiac muscle fibers ( 5 ) , is the Ca" triggering hypothesis, where Ca" acts as a second messenger.According to this hypothesis,

A procedure for the isolation of highly purified sarcoplasmic reticulum vesicles from rabbit skeletal muscle has been described using sucrose gradient centrifugation in zonal rotors. The yield of our purest fraction was 300 mg of sarcoplasmic reticulum protein using 1 kg muscle. The sarcoplasmic reticulum vesicles were relatively simple in composition. The Ca2+-pump protein accounted for most (approx. two-thirds) of the sarcoplasmic reticulum protein. Two other protein components, a Ca2+-binding protein and a M55 protein (approx. 55 000 daltons) each accounted for about 5–10% of the protein. Enrichment in the level of phosphoenzyme by the Ca2+-pump protein was regarded as an important index of the purification of sarcoplasmic reticulum vesicles. The sarcoplasmic reticulum vesicles were capable of forming 6.4 nmoles of 32P-labelled phosphoenzyme per mg protein and had a high capacity of energized Ca2+ uptake. The Ca2+-dependent formation of phosphoenzyme has been used to estimate the sarcoplasmic reticulum protein content in rabbit skeletal muscle and found to be about 2.5% of the total muscle protein. The Ca2+-pump and Ca2+-binding proteins were isolated with a purity of 90% or more by treating the purified sarcoplasmic reticulum vesicles with bile acids in the presence of salt. The solubilized Ca2+-pump protein reaggregated during dialysis together with phospholipid to form membranous vesicles which were capable of forming approx. 9 nmoles 32P-labelled phosphoenzyme per mg protein. The Ca2+-binding protein was water soluble and contained a high percentage of acidic amino acids (35% of total residues). Ca2+ binding by sarcoplasmic reticulum vesicles and by the Ca2+-pump and Ca2+-binding proteins was studied by equilibrium dialysis. Sarcoplasmic reticulum vesicles and Ca2+-pump protein contained nonspecific high-affinity Ca2+ binding sites with a capacity of 90–100 and 55–70 nmoles Ca2+ per mg protein, respectively. Both of them specifically bound 10–15 nmoles Ca2+ per mg protein. The binding constants for nonspecific and specific Ca2+ binding by both preparations were approx. 1 μM−1. The Ca2+-binding protein nonspecifically bound 900–1000 nmoles Ca2+ per mg protein with a binding constant of about 0.25 μM−1.

ADVERTISEMENT RETURN TO ISSUEPREVArticleNEXTKinetics of rapid calcium release by sarcoplasmic reticulum. Effects of calcium, magnesium, and adenine nucleotidesGerhard Meissner, Edward Darling, and Julia EvelethCite this: Biochemistry 1986, 25, 1, 236–244Publication Date (Print):January 14, 1986Publication History Published online1 May 2002Published inissue 14 January 1986https://pubs.acs.org/doi/10.1021/bi00349a033https://doi.org/10.1021/bi00349a033research-articleACS PublicationsRequest reuse permissionsArticle Views442Altmetric-Citations330LEARN ABOUT THESE METRICSArticle Views are the COUNTER-compliant sum of full text article downloads since November 2008 (both PDF and HTML) across all institutions and individuals. These metrics are regularly updated to reflect usage leading up to the last few days.Citations are the number of other articles citing this article, calculated by Crossref and updated daily. Find more information about Crossref citation counts.The Altmetric Attention Score is a quantitative measure of the attention that a research article has received online. Clicking on the donut icon will load a page at altmetric.com with additional details about the score and the social media presence for the given article. Find more information on the Altmetric Attention Score and how the score is calculated. Share Add toView InAdd Full Text with ReferenceAdd Description ExportRISCitationCitation and abstractCitation and referencesMore Options Share onFacebookTwitterWechatLinked InRedditEmail Other access optionsGet e-Alertsclose Get e-Alerts

Abstract

 Ion channels have been studied extensively in ambient O₂ tension (pO₂), whereas tissue pO₂ is much lower. The skeletal muscle calcium release channel/ryanodine receptor (RyR1) is one prominent example. Here we report that pO₂ dynamically controls the redox state of 6–8 out of 50 thiols in each RyR1 subunit and thereby tunes the response to NO. At physiological pO₂, nanomolar NO activates the channel by S-nitrosylating a single cysteine residue. Among sarcoplasmic reticulum proteins, S-nitrosylation is specific to RyR1 and its effect on the channel is calmodulin dependent. Neither activation nor S-nitrosylation of the channel occurs at ambient pO₂. The demonstration that channel cysteine residues subserve coupled O₂ sensor and NO regulatory functions and that these operate through the prototypic allosteric effector calmodulin may have general implications for the regulation of redox-related systems.

A purified preparation of sarcoplasmic reticulum from rabbit skeletal muscle has been found to consist of a heterogeneous population of vesicles. Isopycnic centrifugation was used to obtain "light" and "heavy" vesicles from the upper and lower ends of a 25 to 45% (w/w) linear sucrose gradient. Each fraction accounted for about 10 to 15% of the total vesicles. The remainder of the vesicles were of intermediate density and banded between the light and heavy fraction. Light vesicles were composed of about equal amounts of phospholipid and Ca2+ pump protein which contained approx. 90% of the protein. Heavy vesicles contained in addition to the Ca2+ pump protein (55–65% of the protein) two other major protein components, the Ca2+ binding and M55 proteins which accounted for 20–25 and 5–7% of the protein of these vesicles, respectively. The sarcoplasmic reticulum subfractions had 32P-labelled phosphoenzyme levels proportional to their Ca2+ pump protein content and contained similar Ca2+ -stimulated ATPase activities. They were capable of accumulating Ca2+ in the presence of ATP and of releasing the accumulated Ca2+ when placed into a medium with a low Ca2+ concentration. The vesicles differed significantly in that heavy vesicles had a greater number of non-specific Ca2+ binding sites than light vesicles (approx. 220 vs 75 nmol of bound Ca2+ per mg protein), in accordance with their high content of Ca2+ binding protein. Electron dense material could be seen within the compartment of heavy but not light vesicles. Removal of Ca2+ binding and M55 proteins from heavy vesicles resulted in empty membranous structures consisting mainly of Ca2+ pump protein and phospholipid. Electron micrographs of sections of muscle showed dense material in terminal cisternae but not in longitudinal sections of sarcoplasmic reticulum. These experiments are consistent with the interpretation that (1) the electron dense material inside heavy vesicles may be referable to Ca2+ binding and/or M55 proteins, and that (2) light and heavy vesicles may be derived from the longitudinal sections and terminal cisternae of sarcoplasmic reticulum, respectively.