With the indirect immunofluorescence technique of Coons and collaborators a possible coexistence of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and substance P in neurons of the lower medulla oblongata was explored. Antisera to 5-HT and to dopadecarboxylase (aromaticl-aminoacid decarboxylase), an enzyme probably present in immunologically indistinguishable forms both in catecholamine and 5-HT neurons, were used as markers for 5-HT neurons and an antiserum raised to synthetic substance P conjugated with bovine serum albumin for substance P-containing neurons. Five or 10 μm thick, consecutive sections were stained with the three antisera. Numerous cell somata in nucleus raphe magnus, nucleus raphe obscurus, nucleus raphe pallidus, pars α of the nucleus reticularis gigantocellularis and nucleus interfascicularis hypoglossi contained both substance P-like immunoreactivity and 5-HT (and dopadecarboxylase) immunoreactive material. After intraventricular or intracisternal injections of 5,6- or 5,7-dihydroxytryptamine, two neurotoxins assumed to cause degeneration mainly of 5-HT neurons, enlarged substance P and 5-HT (and dopadecarboxylase) positive fibres were seen in, around and lateral to the olivary complex. Furthermore, in these rats both substance P and 5-HT positive nerve terminals in the ventral horns of the spinal cord disappeared. These findings indicate that substance P and 5-HT may coexist not only in some cell bodies but also in axons and nerve endings. The latter conclusion must, however, remain tentative since the neurotoxins may cause unspecific damage and thus not only damage 5-HT (and postulated 'SP-5-HT') neurons. In further experiments reserpine was used, a drug known to deplete monoamines by affecting their storage sites. With a high dose of reserpine a marked depletion of 5-HT was obtained both in nerve terminals and cell bodies whereas substance P immunoreactive material seemed unaffected. Possible interpretations of these findings is that substance P and 5-HT have different storage sites within the neuron, or that reserpine selectively causes loss of 5-HT and not substance P from the same storage site.

Using indirect immunofluorescence histochemistry, in part combined with the elution and restaining technique of Tramu et al., 1978 Tramu G. Pillez A. Leonardelli J. An efficient method of antibody elution for the successive or simultaneous localization of two antigens by immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 1978; 26: 322-324 Crossref PubMed Google Scholar , the distribution of 5-hydroxytryptamine (5-HT), thyrotropin releasing hormone (TRH) and substance P immunoreactive neurons has been studied in the medulla oblongata and spinal cord of normal and colchicine-treated rats. Evidence was obtained that at least some cell bodies in the medullary raphe nuclei and adjacent areas contained all three compounds, 5-HT, TRH and substance P. Other cell bodies in the same areas may contain two or only one of these three putative transmitters. Alternatively, the intraneuronal levels of one or two of the substances may be too low to be detected with the present technique, in spite of the fact that colchicine treatment was used to elevate peptide levels in the cell somata. In a quantitative evaluation the proportion of 5-HT, TRH and substance P neurons was calculated at different levels and in different nuclei of the medulla oblongata. Out of all immunoreactive neurons, there were approximately twice as many 5-HT (56%) as TRH (23%) and substance P (21%) cells respectively, and this relation was also found in several major subnuclei, such as the nucleus raphe magnus and nucleus raphe obscurus. In the 'arcuate' region very high proportions of 5-HT cells (about 60–80%) were observed with only few substance P cells (2–12%). The 'parapyramidal' and 'paraolivar' regions, which include the nucleus interfascicularis hypoglossi, had more substance P (26–36%) than TRH (15–17%) cells. The most 'even' distribution was observed in the nucleus raphe pallidus (5-HT: 43%; TRH: 32%; substance P: 25%). The evaluation also indicated how the respective cell type (5-HT, TRH and substance P cells) distributed between the different subnuclei. Thus, at rostral levels the 'suprapyramidal' region contained a large proportion (about 30%) of the total numbers of counted 5-HT, TRH and substance P cells, respectively. Furthermore, the nucleus raphe magnus contained a large part (about 30%) of the TRH and substance P cells, but a smaller fraction (about 20%) of the 5-HT cells. Analysis of adjacent sections at regular intervals confirmed the overall quantitative evaluation. Generally, the distribution of 5-HT, TRH and substance P cells were roughly parallel. An exception was the midportion of the rostral medulla oblongata, where 5-HT cells were very numerous. Of particular interest was the fact that, especially in the nucleus raphe pallidus, there were in several series almost the same number of 5-HT, TRH and substance P cells, supporting the view that many cells in this nucleus contained all these compounds. In the spinal cord overlapping networks of 5-HT, TRH and substance P immunoreactive fibres were observed in the ventral horn. The number of 5-HT immunoreactive fibres seemed higher than the TRH and substance P immunoreactive ones. After treatment with the neurotoxins 5,6- or 5,7-dihydroxytryptamine there was an almost complete disappearance of all three types of fibres in the ventral horn, further supporting the occurrence of the two peptides in 5-HT neurons, either both of them together in the same 5-HT neuron or each of them in separate 5-HT neurons. It is, however, important to note that there are, in all probability, 5-HT neurons in the lower medulla oblongata which contain neither TRH nor substance P. Furthermore, in other brain regions there is no certain correlation between the distribution patterns of 5-HT, TRH and substance P immunoreactive cells. The results are consistent with the coexistence of 5-HT, TRH and substance P in neurons of the medulla oblongata that project to the spinal cord. Some neurons may contain detectable levels only of 5-HT and substance P, others only of 5-HT and TRH, while others contain all three substances. It can, however, not be excluded that some neurons contain only one of these compounds or that other combinations exist.

A detailed description is given of an immunohistochemical technique for the localization of serotonin in the central nervous system of the rat. In rabbits antibodies were raised against an antigen prepared by coupling serotonin to bovine serum albumin using formaldehyde as a coupling reagent. In the antisera two types of antibodies, one against the bovine serum albumin-serotonin complex and another type directed to bovine serum albumin were demonstrated by immunoelectrophoresis. The antibodies to serum albumin could be removed by affinity chromatography. Brains and spinal cords of rats were fixed by perfusion with ice-cold 4% formaldehyde in 0.1m-sodium phosphate buffer (pH 7.3) and sectioned on a cryostat. The sections were stained by the indirect immunofluorescence technique. Immunofluorescence specific for serotonin was observed in cell bodies and fibre systems. The antisera could be diluted up to 1:1024 provided a prolonged incubation at 4°C was employed. The specificity of the antisera was examined by inhibition tests. From these tests it was estimated that in the central nervous system of the rat there might be a cross-reactivity of approximately 2% to 5-methoxytryptamine and dopamine and less than 1% to noradrenaline and adrenaline under the conditions which were used. Thus the procedure appears to be a specific and sensitive technique for the localization of serotonin in the central nervous system; it has the advantage that adjacent sections can be examined by the immunofluorescence method using antisera to a variety of antigens. The application of this technique is some parts of the brain and spinal cord of the rat is demonstrated.

Epigenetic dysregulation of gene expression is thought to be critically involved in the pathophysiology of Alzheimer's disease (AD). Recent studies indicate that DNA methylation and DNA hydroxymethylation are 2 important epigenetic mechanisms that regulate gene expression in the aging brain. However, very little is known about the levels of markers of DNA methylation and hydroxymethylation in the brains of patients with AD, the cell-type specificity of putative AD-related alterations in these markers, as well as the link between epigenetic alterations and the gross pathology of AD. The present quantitative immunohistochemical study investigated the levels of the 2 most important markers of DNA methylation and hydroxymethylation, that is, 5-methylcytidine (5-mC) and 5-hydroxymethylcytidine (5-hmC), in the hippocampus of AD patients (n = 10) and compared these to non-demented, age-matched controls (n = 10). In addition, the levels of 5-hmC in the hippocampus of a pair of monozygotic twins discordant for AD were assessed. The levels of 5-mC and 5-hmC were furthermore analyzed in a cell-type and hippocampal subregion–specific manner, and were correlated with amyloid plaque load and neurofibrillary tangle load. The results showed robust decreases in the hippocampal levels of 5-mC and 5-hmC in AD patients (19.6% and 20.2%, respectively). Similar results were obtained for the twin with AD when compared to the non-demented co-twin. Moreover, levels of 5-mC as well as the levels of 5-hmC showed a significant negative correlation with amyloid plaque load in the hippocampus (rp = −0.539, p = 0.021 for 5-mC and rp = −0.558, p = 0.016 for 5-hmC). These human postmortem results thus strengthen the notion that AD is associated with alterations in DNA methylation and hydroxymethylation, and provide a basis for further epigenetic studies identifying the exact genetic loci with aberrant epigenetic signatures.

The distribution of serotonin-immunoreactive varicosities in the paraventricular (PVH) and supraoptic (SO) nuclei was charted in normal immunohistochemical material and the probable cells of origin of these projections were identified using a combined retrograde transport-immunohistochemical method. The density of serotonergic fibers in the PVH and the SO is quite low relative to that in the immediately surrounding neuropil, in striking contrast to noradrenergic inputs to the nuclei. Immunoreactive fibers are concentrated in specific parts of the parvocellular division of the PVH, whereas in the magnocellular division of the nucleus, and in the SO, they are found mostly in regions where oxytocinergic cells predominate. These projections appear to arise from 3 distinct serotonergic cell groups (B7, B8 and B9) in the midbrain.

We have studied the localization of serotonin- and non-serotonin-containing cell bodies in the midbrain raphe nuclei that project to the entorhinal area and the hippocampal formation in the rat brain, using the technique of combined retrograde fluorescent tracing and immunohistochemistry on the same tissue section. The branching properties of these neurons were studied by retrograde double labelling using two fluorochromes which emit fluorescence with different spectral characteristics. After injections of granular blue or propidium iodide into the medial entorhinal area, retrogradely-labelled cells were found situated bilaterally in the caudal half of the dorsal raphe nucleus, the medial part of the median raphe and throughout the rostrocaudal extension of the nucleus reticularis tegmentipontis. Injections placed successively more laterally in the entorhinal area labelled progressively less cells contralaterally in the dorsal raphe and the reticular tegmental nucleus of the pons. After fluorochrome injections into the dorsal part of the hippocampal formation, retrogradely-labelled cells were found in the caudal part of the dorsal raphe, in the peripheral part of the median raphe and to a minor extent in the medial part of this nucleus, but not in the nucleus reticularis tegmentipontis. The experiments with double retrograde fluorescent tracing showed that the raphe nuclei do not send bilateral projections to the entorhinal area in spite of the fact that many of these cells are located contralateral to the injected hemisphere in single labelling experiments. Injections of the fluorochromes into the entorhinal area and hippocampal formation showed that at least 10% of the raphe cells project to both areas simultaneously. Analysis of sections incubated with antiserum to serotonin showed that a majority of the retrogradely-labelled versus serotonin-immunoreactive cells was found to vary within different parts of the individual raphe nuclei: the ventromedial part of the dorsal, the medial part of the median and the nucleus reticularis tegmentipontis being the highest. The findings indicate that both serotonin- and non-serotonin-containing neurons in the raphe innervate the hippocampal region, that these projections may be crossed but not bilateral, and that the same neuron in the raphe may influence the neural activity in the entorhinal area and the hippocampus simultaneously.