CAR-T-cell therapy has shown considerable advance in recent years, being approved by regulatory agencies in US, Europe, and Japan for the treatment of refractory patients with CD19+ B-cell leukemia or diffuse large B-cell lymphoma. Current methods for CAR-T-cell production use viral vectors for T-cell genetic modification and can take up to 15 days to generate the infusion product. The development of simple and less costly manufacturing protocols is needed in order to meet the increasing demand for this therapy. In this present work, we generated 19BBz CAR-T cells in 8 days using a protocol based on the non-viral transposon-based vector Sleeping Beauty. The expanded cells display mostly a central memory phenotype, expressing higher levels of inhibitory receptors when compared with mock cells. In addition, CAR-T cells were cytotoxic against CD19+ leukemia cells in vitro and improved overall survival rates of mice xenografted with human RS4;11 or Nalm-6 B-cell leukemias. Infused CAR-T cells persisted for up to 28 days, showing that they are capable of long-term persistence and antitumor response. Altogether, these results demonstrate the effectiveness of our protocol and pave the way for a broader application of CAR-T-cell therapy.

Recently approved by the FDA and European Medicines Agency, CAR-T cell therapy is a new treatment option for B-cell malignancies. Currently, CAR-T cells are manufactured in centralized facilities and face bottlenecks like complex scaling up, high costs, and logistic operations. These difficulties are mainly related to the use of viral vectors and the requirement to expand CAR-T cells to reach the therapeutic dose. In this paper, by using Sleeping Beauty-mediated genetic modification delivered by electroporation, we show that CAR-T cells can be generated and used without the need for ex vivo activation and expansion, consistent with a point-of-care (POC) approach. Our results show that minimally manipulated CAR-T cells are effective in vivo against RS4;11 leukemia cells engrafted in NSG mice even when inoculated after only 4 h of gene transfer. In an effort to better characterize the infused CAR-T cells, we show that 19BBz T lymphocytes infused after 24 h of electroporation (where CAR expression is already detectable) can improve the overall survival and reduce tumor burden in organs of mice engrafted with RS4;11 or Nalm-6 B cell leukemia. A side-by-side comparison of POC approach with a conventional 8-day expansion protocol using Transact beads demonstrated that both approaches have equivalent antitumor activity in vivo. Our data suggest that POC approach is a viable alternative for the generation and use of CAR-T cells, overcoming the limitations of current manufacturing protocols. Its use has the potential to expand CAR immunotherapy to a higher number of patients, especially in the context of low-income countries.

Abstract Introduction: CD19-targeted CAR-T cell immunotherapy is now an approved treatment for B cell leukemias and lymphomas. Current protocols for producing CAR-T cells use viral vectors for genetic modification and take 12-15 days to expand sufficient numbers of T cells, constituting an important bottleneck for the widespread use of this therapy. The development of non-viral, plasmid-based systems like Sleeping Beauty (SB) transposons, coupled with the emergence of large scale, closed electroporation devices, present the opportunity of generating high numbers of CAR-T cells in a short period of time and transforming this in a point-of-care (POC) therapy. Methods and Results: In this work, mononuclear cells were isolated using Ficoll and electroporated using Nucleofector IIb electroporator combined with plasmids encoding 19BBz CAR (in the pT3 SB transposon backbone) and SB100x transposase. Cells were rested for 24h and used for in vitro and in vivo experiments. The phenotype was assessed by flow cytometry. The in vitro cytotoxicity assay was performed using Calcein-AM dye on target cells incubated with different ratios of effector cells. 8-12-week-old-female-NSG were injected iv. 5 × 106 RS4;11 GFP or 105 Nalm-6 GFP and after 3 days were treated with different doses of recently electroporated CAR-T cells. CAR expression on day 1 following electroporation ranged between 5-15% and in vitro cytotoxic activity against RS4;11 or Nalm-6 CD19+ B cell precursor leukemia lines was low or absent. NSG mice engrafted with RS4;11 and treated with 1 × 105 19BBz+ cells showed improved survival when compared to mice treated with mock electroporated cells. POC approach was also efficient against Nalm-6, where 19BBz+CAR-T cells (7 × 105 per mice) improved the survival of mice. In both models, decreased tumor burden in blood and spleen was observed in mice treated with 19BBz. Head to head comparison of 19BBz cells used in POC approach or expanded for 8-12 days in vitro showed similar antitumor activity in vivo against RS4;11 cells, leading to equivalent improvements in mice survival. Conclusion: In summary, we show that the POC strategy is a viable approach for the use of CAR-T cells, obviating the need for T cell expansion while having the potential to greatly decrease the total cost and time of CAR-T cell therapy manufacturing. Citation Format: Luiza Abdo, Luciana Rodrigues Barros, Mariana Saldanha Viegas, Luisa Vieira Marques, Priscila de Sousa Ferreira, Leonardo Chicaybam, Martín Hernán Bonamino. Development of CAR-T cell therapy for B-ALL using a point-of-care approach [abstract]. In: Proceedings of the Annual Meeting of the American Association for Cancer Research 2020; 2020 Apr 27-28 and Jun 22-24. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2020;80(16 Suppl):Abstract nr 3247.

Abstract Recently approved by the FDA and European Medicines Agency, CAR-T cell therapy is a new treatment option for B-cell malignancies. Currently, CAR-T cells are manufactured in centralized facilities and face bottlenecks like complex scaling up, high costs and logistic operations. These difficulties are mainly related to the use of viral vectors and the requirement to expand CAR-T cells to reach the therapeutic dose. In this paper, by using Sleeping Beauty-mediated genetic modification delivered by electroporation, we show that CAR-T cells can be generated and used without the need for ex vivo activation and expansion, consistent with a point-of-care (POC) approach. Our results show that minimally manipulated CAR-T cells are effective in vivo against RS4;11 leukemia cells engrafted in NSG mice even when inoculated after only 4 hours of gene transfer. In an effort to better characterize the infused CAR-T cells, we show that 19BBz T lymphocytes infused after 24h of electroporation (where CAR expression is already detectable) can improve the overall survival and reduce tumor burden in organs of mice engrafted with RS4;11 or Nalm-6 B cell leukemia. A side-by-side comparison of POC approach with a conventional 8-day expansion protocol using Transact beads demonstrated that both approaches have equivalent antitumor activity in vivo . Our data suggests that POC approach is a viable alternative for the generation and use of CAR-T cells, overcoming the limitations of current manufacturing protocols. Its use has the potential to expand CAR immunotherapy to a higher number of patients, especially in the context of low-income countries.