The spatial relation between mitochondria and endoplasmic reticulum (ER) in living HeLa cells was analyzed at high resolution in three dimensions with two differently colored, specifically targeted green fluorescent proteins. Numerous close contacts were observed between these organelles, and mitochondria in situ formed a largely interconnected, dynamic network. A Ca 2+ -sensitive photoprotein targeted to the outer face of the inner mitochondrial membrane showed that, upon opening of the inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 )–gated channels of the ER, the mitochondrial surface was exposed to a higher concentration of Ca 2+ than was the bulk cytosol. These results emphasize the importance of cell architecture and the distribution of organelles in regulation of Ca 2+ signaling.

Central to the role of the mitochondrion in cellular metabolism is its ability to control the fluxes of the key signalling ion, Ca2+. This is done by a highly selective ion channel known as the mitochondrial calcium uniporter. The molecular nature of this channel has remained elusive, but now two groups report the identification of a 40-kilodalton protein in the inner membrane of mitochondria as the active channel of the uniporter. This protein contains two transmembrane domains and exhibits calcium-channel activity in vitro and in vivo. Mitochondrial Ca2+ homeostasis has a key role in the regulation of aerobic metabolism and cell survival1, but the molecular identity of the Ca2+ channel, the mitochondrial calcium uniporter2, is still unknown. Here we have identified in silico a protein (named MCU) that shares tissue distribution with MICU1 (also known as CBARA1), a recently characterized uniporter regulator3, is present in organisms in which mitochondrial Ca2+ uptake was demonstrated and whose sequence includes two transmembrane domains. Short interfering RNA (siRNA) silencing of MCU in HeLa cells markedly reduced mitochondrial Ca2+ uptake. MCU overexpression doubled the matrix Ca2+ concentration increase evoked by inositol 1,4,5-trisphosphate-generating agonists, thus significantly buffering the cytosolic elevation. The purified MCU protein showed channel activity in planar lipid bilayers, with electrophysiological properties and inhibitor sensitivity of the uniporter. A mutant MCU, in which two negatively charged residues of the putative pore-forming region were replaced, had no channel activity and reduced agonist-dependent matrix Ca2+ concentration transients when overexpressed in HeLa cells. Overall, these data demonstrate that the 40-kDa protein identified is the channel responsible for ruthenium-red-sensitive mitochondrial Ca2+ uptake, thus providing a molecular basis for this process of utmost physiological and pathological relevance.

The voltage-dependent anion channel (VDAC) of the outer mitochondrial membrane mediates metabolic flow, Ca(2+), and cell death signaling between the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondrial networks. We demonstrate that VDAC1 is physically linked to the endoplasmic reticulum Ca(2+)-release channel inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP(3)R) through the molecular chaperone glucose-regulated protein 75 (grp75). Functional interaction between the channels was shown by the recombinant expression of the ligand-binding domain of the IP(3)R on the ER or mitochondrial surface, which directly enhanced Ca(2+) accumulation in mitochondria. Knockdown of grp75 abolished the stimulatory effect, highlighting chaperone-mediated conformational coupling between the IP(3)R and the mitochondrial Ca(2+) uptake machinery. Because organelle Ca(2+) homeostasis influences fundamentally cellular functions and death signaling, the central location of grp75 may represent an important control point of cell fate and pathogenesis.

Microdomains of high intracellular calcium ion concentration, [Ca 2+ ] i , have been hypothesized to occur in living cells exposed to stimuli that generate inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3 ). Mitochondrially targeted recombinant aequorin was used to show that IP 3 -induced Ca 2+ mobilization from intracellular stores caused increases of mitochondrial Ca 2+ concentration, [Ca 2+ ] m , the speed and amplitude of which are not accounted for by the relatively small increases in mean [Ca 2+ ] i . A similar response was obtained by the addition of IP 3 to permeabilized cells but not by perfusion of cells with Ca 2+ at concentrations similar to those measured in intact cells. It is concluded that in vivo, domains of high [Ca 2+ ] i are transiently generated close to IP 3 -gated channels and sensed by nearby mitochondria; this may provide an efficient mechanism for optimizing mitochondrial activity upon cell stimulation.

The view of the lysosome as the terminal end of cellular catabolic pathways has been challenged by recent studies showing a central role of this organelle in the control of cell function. Here we show that a lysosomal Ca2+ signalling mechanism controls the activities of the phosphatase calcineurin and of its substrate TFEB, a master transcriptional regulator of lysosomal biogenesis and autophagy. Lysosomal Ca2+ release through mucolipin 1 (MCOLN1) activates calcineurin, which binds and dephosphorylates TFEB, thus promoting its nuclear translocation. Genetic and pharmacological inhibition of calcineurin suppressed TFEB activity during starvation and physical exercise, while calcineurin overexpression and constitutive activation had the opposite effect. Induction of autophagy and lysosomal biogenesis through TFEB required MCOLN1-mediated calcineurin activation. These data link lysosomal calcium signalling to both calcineurin regulation and autophagy induction and identify the lysosome as a hub for the signalling pathways that regulate cellular homeostasis. Medina, Ballabio and colleagues report that calcium release from the lysosome stimulates calcineurin, which dephosphorylates and activates TFEB. These findings reveal a central role for calcium signalling in autophagy and lysosome homeostasis.

Reactive oxygen species (ROS) are potent inducers of oxidative damage and have been implicated in the regulation of specific cellular functions, including apoptosis. Mitochondrial ROS increase markedly after proapoptotic signals, though the biological significance and the underlying molecular mechanisms remain undetermined. P66Shc is a genetic determinant of life span in mammals, which regulates ROS metabolism and apoptosis. We report here that p66Shc is a redox enzyme that generates mitochondrial ROS (hydrogen peroxide) as signaling molecules for apoptosis. For this function, p66Shc utilizes reducing equivalents of the mitochondrial electron transfer chain through the oxidation of cytochrome c. Redox-defective mutants of p66Shc are unable to induce mitochondrial ROS generation and swelling in vitro or to mediate mitochondrial apoptosis in vivo. These data demonstrate the existence of alternative redox reactions of the mitochondrial electron transfer chain, which evolved to generate proapoptotic ROS in response to specific stress signals.

Multiple cellular stressors, including activation of the tumour suppressor p53, can stimulate autophagy. Here we show that deletion, depletion or inhibition of p53 can induce autophagy in human, mouse and nematode cells subjected to knockout, knockdown or pharmacological inhibition of p53. Enhanced autophagy improved the survival of p53-deficient cancer cells under conditions of hypoxia and nutrient depletion, allowing them to maintain high ATP levels. Inhibition of p53 led to autophagy in enucleated cells, and cytoplasmic, not nuclear, p53 was able to repress the enhanced autophagy of p53−/− cells. Many different inducers of autophagy (for example, starvation, rapamycin and toxins affecting the endoplasmic reticulum) stimulated proteasome-mediated degradation of p53 through a pathway relying on the E3 ubiquitin ligase HDM2. Inhibition of p53 degradation prevented the activation of autophagy in several cell lines, in response to several distinct stimuli. These results provide evidence of a key signalling pathway that links autophagy to the cancer-associated dysregulation of p53.

Macroautophagy is an evolutionary conserved lysosomal pathway involved in the turnover of cellular macromolecules and organelles. In spite of its essential role in tissue homeostasis, the molecular mechanisms regulating mammalian macroautophagy are poorly understood. Here, we demonstrate that a rise in the free cytosolic calcium ([Ca(2+)](c)) is a potent inducer of macroautophagy. Various Ca(2+) mobilizing agents (vitamin D(3) compounds, ionomycin, ATP, and thapsigargin) inhibit the activity of mammalian target of rapamycin, a negative regulator of macroautophagy, and induce massive accumulation of autophagosomes in a Beclin 1- and Atg7-dependent manner. This process is mediated by Ca(2+)/calmodulin-dependent kinase kinase-beta and AMP-activated protein kinase and inhibited by ectopic Bcl-2 located in the endoplasmatic reticulum (ER), where it lowers the [Ca(2+)](ER) and attenuates agonist-induced Ca(2+) fluxes. Thus, an increase in the [Ca(2+)](c) serves as a potent inducer of macroautophagy and as a target for the antiautophagy action of ER-located Bcl-2.

In recent years, mitochondria have emerged as important targets of agonist-dependent increases in cytosolic Ca 2+ concentration. Here, we analyzed the significance of Ca 2+ signals for the modulation of organelle function by directly measuring mitochondrial and cytosolic ATP levels ([ATP] m and [ATP] c , respectively) with specifically targeted chimeras of the ATP-dependent photoprotein luciferase. In both HeLa cells and primary cultures of skeletal myotubes, stimulation with agonists evoking cytosolic and mitochondrial Ca 2+ signals caused increases in [ATP] m and [ATP] c that depended on two parameters: ( i ) the amplitude of the Ca 2+ rise in the mitochondrial matrix, and ( ii ) the availability of mitochondrial substrates. Moreover, the Ca 2+ elevation induced a long-lasting priming that persisted long after agonist washout and caused a major increase in [ATP] m upon addition of oxidative substrates. These results demonstrate a direct role of mitochondrial Ca 2+ in driving ATP production and unravel a form of cellular memory that allows a prolonged metabolic activation in stimulated cells.