Gaucher disease (GD; glucosylceramidosis) is caused by a deficient activity of the enzyme glucocerebrosidase (GC). Clinical manifestations are highly variable and cannot be predicted accurately on the basis of the properties of mutant GC. Analysis of secondary abnormalities, such as elevated plasma levels of some hydrolases, may help to increase insight into the complicated pathophysiology of the disease and could also provide useful disease markers. The recent availability of enzyme supplementation therapy for GD increases the need for markers as early predictors of the efficacy of treatment. We report the finding of a very marked increase in chitotrisidase activity in plasma of 30 of 32 symptomatic type 1 GD patients studied: the median activity being > 600 times the median value in plasma of healthy volunteers. In three GC-deficient individuals without clinical symptoms, only slight increases were noted. Chitotriosidase activity was absent in plasma of three control subjects and two patients. During enzyme supplementation therapy, chitotriosidase activity declined dramatically. We conclude that plasma chitotriosidase levels can serve as a new diagnostic hallmark of GD and should prove to be useful in assessing whether clinical manifestations of GD are present and for monitoring the efficacy of therapeutic intervention.

Background Current treatment for Gaucher's disease involves administration of intravenous glucocerebrosidase to degrade glucocerebroside stored in lysosomes. Lowering the rate of biosynthesis of glucocerebroside should decrease accummulation of this substrate. We investigated the safety and efficacy of OGT 918 (N-butyldeoxynojirimycin), an inhibitor of glucosyltransferase, as a novel oral treatment for non-neuronopathic Gaucher's disease. Methods We recruited, into a 1-year open-label study, 28 adults (seven with previous splenectomies) from four national Gaucher's referral clinics, who were unable or unwilling to receive enzyme treatment. We measured liver and spleen volume by computed tomography or magnetic resonance imaging at baseline and at months 6 and 12, and biochemical and haematological variables monthly, including chitotriosidase activity (a sensitive marker of Gaucher's disease activity). Patients were started on 100 mg oral OGT 918 three times daily. Findings Baseline liver volumes were 1·1–2·7 times normal and spleen volumes 5·1–24·8 times normal. At 12 months, mean liver and spleen volumes were significantly lowered by 12% (95% Cl 7·8–16·4) and 19% (14·3–23·7), respectively (each p<0·001). Haematological variables improved slightly. Mean organ volume and blood counts improved continually between 6 months and 12 months of treatment. Mean chitotriosidase concentrations fell by 16·4% over 12 months (p<0·001). Six patients withdrew because of gastrointestinal complaints (two), personal reasons (two), or severe pre-existing disease (two). The most frequent adverse effect was diarrhoea, which occurred in 79% of patients shortly after the start of treatment. Interpretation Decrease of substrate formation by OGT 918 improves key clinical features of non-neuronopathic Gaucher's disease. The strategy justifies further trials in this and other glycosphingolipid storage disorders.

Fabry disease is an X-linked lysosomal storage disease caused by deficiency of α-galactosidase A that affects males and shows disease expression in heterozygotes. The characteristic progressive renal insufficiency, cardiac involvement, and neuropathology usually are ascribed to globotriaosylceramide accumulation in the endothelium. However, no direct correlation exists between lipid storage and clinical manifestations, and treatment of patients with recombinant enzymes does not reverse several key signs despite clearance of lipid from the endothelium. We therefore investigated the possibility that globotriaosylceramide metabolites are a missing link in the pathogenesis. We report that deacylated globotriaosylceramide, globotriaosylsphingosine, and a minor additional metabolite are dramatically increased in plasma of classically affected male Fabry patients and plasma and tissues of Fabry mice. Plasma globotriaosylceramide levels are reduced by therapy. We show that globotriaosylsphingosine is an inhibitor of α-galactosidase A activity. Furthermore, exposure of smooth muscle cells, but not fibroblasts, to globotriaosylsphingosine at concentrations observed in plasma of patients promotes proliferation. The increased intima-media thickness in Fabry patients therefore may be related to the presence of this metabolite. Our findings suggest that measurement of circulating globotriaosylsphingosine will be useful to monitor Fabry disease and may contribute to a better understanding of the disorder.

Chitinases are ubiquitous chitin-fragmenting hydrolases. Recently we discovered the first human chitinase, named chitotriosidase, that is specifically expressed by phagocytes. We here report the identification, purification, and subsequent cloning of a second mammalian chitinase. This enzyme is characterized by an acidic isoelectric point and therefore named acidic mammalian chitinase (AMCase). In rodents and man the enzyme is relatively abundant in the gastrointestinal tract and is found to a lesser extent in the lung. Like chitotriosidase, AMCase is synthesized as a 50-kDa protein containing a 39-kDa N-terminal catalytic domain, a hinge region, and a C-terminal chitin-binding domain. In contrast to chitotriosidase, the enzyme is extremely acid stable and shows a distinct second pH optimum around pH 2. AMCase is capable of cleaving artificial chitin-like substrates as well as crab shell chitin and chitin as present in the fungal cell wall. Our study has revealed the existence of a chitinolytic enzyme in the gastrointestinal tract and lung that may play a role in digestion and/or defense. Chitinases are ubiquitous chitin-fragmenting hydrolases. Recently we discovered the first human chitinase, named chitotriosidase, that is specifically expressed by phagocytes. We here report the identification, purification, and subsequent cloning of a second mammalian chitinase. This enzyme is characterized by an acidic isoelectric point and therefore named acidic mammalian chitinase (AMCase). In rodents and man the enzyme is relatively abundant in the gastrointestinal tract and is found to a lesser extent in the lung. Like chitotriosidase, AMCase is synthesized as a 50-kDa protein containing a 39-kDa N-terminal catalytic domain, a hinge region, and a C-terminal chitin-binding domain. In contrast to chitotriosidase, the enzyme is extremely acid stable and shows a distinct second pH optimum around pH 2. AMCase is capable of cleaving artificial chitin-like substrates as well as crab shell chitin and chitin as present in the fungal cell wall. Our study has revealed the existence of a chitinolytic enzyme in the gastrointestinal tract and lung that may play a role in digestion and/or defense. acidic mammalian chitinase 4-methylumbelliferyl β-d-N,N′-diacetylchitobiose 4-morpholineethanesulfonic acid polyacrylamide gel electrophoresis expressed sequence tag polymerase chain reaction Next to cellulose, chitin is the most abundant glycopolymer on earth, being present as a structural component in coatings of many species, such as the cell wall of most fungi (1Debono M. Gordee R.S. Annu. Rev. Microbiol. 1994; 48: 471-497Crossref PubMed Scopus (363) Google Scholar), the microfilarial sheath of parasitic nematodes (2Fuhrman J.A. Piessens W.F. Mol. Biochem. Parasitol. 1985; 17: 93-104Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar, 3Araujo A.C. Souto-Padron T. de Souza W.J. Histo. Cyto. 1993; 41: 571-578Crossref PubMed Scopus (67) Google Scholar), and the exoskeleton of all types of arthropods (4Neville A.C. Parry D.A. Woodhead-Galloway J. J. Cell Sci. 1976; 21: 73-82Crossref PubMed Google Scholar), and in the lining of guts of many insects (5Shahabuddin M. Kaslow D.C. Exp. Parasit. 1994; 79: 85-88Crossref PubMed Scopus (71) Google Scholar). Chitinases (EC 3.2.1.14) are endo-β-1,4-N-acetylglucosaminidases that can fragment chitin and have been identified in several organisms (6Flach J. Pilet P.E. Jolles P. Experientia. 1992; 48: 701-716Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar). Until a few years ago it was generally assumed that man lacks the ability to produce a functional chitinase. Our observation of a markedly elevated chitotriosidase activity in plasma of symptomatic Gaucher patients formed the basis for the subsequent identification of a human phagocyte-specific chitinase, named chitotriosidase (7Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (748) Google Scholar, 8Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (265) Google Scholar, 9Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar). Tissue macrophages can synthesize large amounts of chitotriosidase upon an appropriate stimulus, such as the massive lysosomal lipid accumulation that occurs in macrophages of Gaucher patients (7Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (748) Google Scholar). Chitotriosidase is largely secreted as a 50-kDa active enzyme containing a C-terminal chitin binding domain (10Renkema G.H. Boot R.G. Strijland A. Donker-Koopman W.E. van den Berg M. Muijsers A.O. Aerts J.M.F.G. Eur. J. Biochem. 1997; 244: 279-285Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar, 11Tjoelker L.W. Gosting L. Frey S. Hunter C.L. Trong H.L. Steiner B. Brammer H. Gray P.W. J. Biol. Chem. 2000; 275: 514-520Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (114) Google Scholar). In macrophages some enzyme is proteolytically processed to a C-terminally truncated 39-kDa form with hydrolase activity that accumulates in lysosomes of these cells (10Renkema G.H. Boot R.G. Strijland A. Donker-Koopman W.E. van den Berg M. Muijsers A.O. Aerts J.M.F.G. Eur. J. Biochem. 1997; 244: 279-285Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). The 50-kDa chitotriosidase form is also synthesized by progenitors of neutrophilic granulocytes (9Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar) and stored in their specific granules (9Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar,12Boussac M. Garin J. Electrophoresis. 2000; 21: 665-672Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar). Chitotriosidase is remarkably homologous to chitinases from plants, bacteria, fungi, nematodes and insects (8Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (265) Google Scholar, 9Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar). Analogous to some plant chitinases, recombinant chitotriosidase has been found to inhibit hyphal growth of chitin-containing fungi such as Candida andAspergillusspecies. 1R. G. Boot, E. F. C. Blommaart, G. W. Gooday, B. A. Friedman, and J. M. F. G. Aerts, manuscript in preparation. 1R. G. Boot, E. F. C. Blommaart, G. W. Gooday, B. A. Friedman, and J. M. F. G. Aerts, manuscript in preparation.The specific expression by phagocytes also suggests a physiological role in defense against chitin-containing pathogens. A recessively inherited deficiency in chitotriosidase activity is frequently encountered (7Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (748) Google Scholar, 13Guo Y.F. He W. Boer A.M. Wevers R.A. Debruijn A.M. Groener J.E.M.M. Hollak C.E.M. Aerts J.M.F.G. Galjaard H. Van Diggelen O.P. J. Inher. Metab. Dis. 1995; 18: 717-722Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar). About 1 in 20 individuals is completely deficient in enzymatically active chitotriosidase, because of a 24-base pair duplication in the chitotriosidase gene (14Boot R.G. Renkema G.H. Verhoek M. Strijland A. Bliek J. de Meulemeester T.M. Mannens M.M. Aerts J.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 25680-25685Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). This duplication, which occurs panethnically, leads to strongly reduced amounts of an abnormally spliced mRNA only, encoding an enzymatically inactive protein that lacks an internal stretch of 29 amino acids (14Boot R.G. Renkema G.H. Verhoek M. Strijland A. Bliek J. de Meulemeester T.M. Mannens M.M. Aerts J.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 25680-25685Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). In Caucasian populations, up to 35‥ of all individuals carry this abnormal chitotriosidase allele and about 5‥ are homozygous for this allele (14Boot R.G. Renkema G.H. Verhoek M. Strijland A. Bliek J. de Meulemeester T.M. Mannens M.M. Aerts J.M. J. Biol. Chem. 1998; 273: 25680-25685Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). The prevalence of deficiency suggests that chitotriosidase no longer fulfills an important defense function under normal circumstances or, alternatively, that other mechanisms may compensate the lack of functional chitotriosidase. To test whether compensatory mechanisms exist, we have searched for other chitinases in mammals. The discovery of a second mammalian chitinolytic enzyme is described here. The properties of this acidic mammalian chitinase (AMCase)2are reported, and the possible implications of its existence are discussed. Chitinase enzyme activity was determined with the fluorogenic substrates 4-methylumbelliferyl β-d-N,N′-diacetylchitobiose (4MU-chitobiose; Sigma) and 4-methylumbelliferyl β-d-N,N′,N“-triacetylchitotriose (Sigma). Assay mixtures contained 0.027 mm substrate and 1 mg/ml of bovine serum albumin in McIlvaine buffer (100 mmcitric acid, 200 mm sodium phosphate) at the indicated pH. The standard enzyme activity assay for human chitotriosidase with 4-methylumbelliferyl β-d-N,N′,N”-triacetylchitotriose substrate was performed at pH 5.2, as previously described (7Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (748) Google Scholar). The standard AMCase enzyme activity assays with 4MU-chitobiose substrate were performed at pH 4.5. Crab shell chitin (Poly- (1Debono M. Gordee R.S. Annu. Rev. Microbiol. 1994; 48: 471-497Crossref PubMed Scopus (363) Google Scholar, 2Fuhrman J.A. Piessens W.F. Mol. Biochem. Parasitol. 1985; 17: 93-104Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar, 3Araujo A.C. Souto-Padron T. de Souza W.J. Histo. Cyto. 1993; 41: 571-578Crossref PubMed Scopus (67) Google Scholar, 4Neville A.C. Parry D.A. Woodhead-Galloway J. J. Cell Sci. 1976; 21: 73-82Crossref PubMed Google Scholar)-β-d-N-acetylglucosamine, Sigma) was used as a natural substrate to determine chitinase activity as described (10Renkema G.H. Boot R.G. Strijland A. Donker-Koopman W.E. van den Berg M. Muijsers A.O. Aerts J.M.F.G. Eur. J. Biochem. 1997; 244: 279-285Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). The chitin fragments were analyzed by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis as described by Jackson (15Jackson P. Biochem. J. 1990; 270: 705-713Crossref PubMed Scopus (285) Google Scholar). Measurements of chitin formation during regeneration of fungal spheroplasts was performed as described by Hector and Braun (16Hector R.F. Braun P.C. J. Clin. Microbiol. 1986; 24: 620-624Crossref PubMed Google Scholar). Briefly, spheroplasts were prepared from the Candida albicans strain CAi-4 (ura3), grown overnight in YPD medium (1‥ yeast extract, 2‥ peptone, 2‥ glucose) at 28 °C. Cells were concentrated by centrifugation and incubated with 2.5 mg/ml zymolyase (100T, ICN Immuno Biologicals, Costa Mesa, CA) in buffer containing 50 mmsodium phosphate, pH 7.5, 1.2 m sorbitol, and 27 mm β-mercaptoethanol for 60 min at 37 °C. After extensive washing, spheroplasts were allowed to regenerate in 96-well microtiter plates in regeneration buffer (0.25‥ (w/v) MES buffer, pH 6.7, containing 0.17‥ (w/v) yeast nitrogen base (without amino acids and ammonium sulfate; Sigma), 0.15‥ (w/v) ammonium sulfate, 2‥ (w/v) glucose, 1.2 m sorbitol, 20 μg/ml uridine) at 37 °C. Chitinase enzyme preparations were added to a final concentration of 3 μg/ml. After a 2-h incubation, 50 μl of 300 μg/ml Calcofluor white (Sigma) in 10 mm sodium phosphate buffer, pH 7.5, containing 1.2 m sorbitol was added. After 5 min the plates were washed with buffer only, and fluorescence was determined using a LS 50 Perkin Elmer fluorimeter (excitation, 405 nm; emission, 450 nm). Detergent-free extracts of mouse tissues were prepared by homogenization in 10 volumes of potassium phosphate buffer, pH 6.5, using an Ultra-turrax and centrifugation for 20 min at 15,000 × g. The mouse intestine extract was adjusted to pH 5.0 by the addition of citric acid (0.2 m); NaCl was added to a final concentration of 2m. A chitin column was prepared by mixing 10 g of swollen Sepharose G25 fine (Amersham Pharmacia Biotech) with 300 mg of colloidal chitin, followed by equilibration with phosphate-buffered saline containing 2 m NaCl. The extracts were applied onto the column with a flow speed of 0.4 ml/min. After extensive washing, bound chitinase was eluted from the column with 8 m urea, which was subsequently removed by dialysis. Protein concentrations were determined according to the method of Lowry et al. (17Lowry O.H. Rosebrough N.J. Farr A.L. Randall R.J. J. Biol. Chem. 1951; 193: 265-275Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) using bovine serum albumin as a standard. Fractions containing chitinase activity were subjected to SDS-PAGE and Western blotting as described (8Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (265) Google Scholar). N-terminal protein sequencing was performed as described using a Procise 494 sequencer (Applied Biosystems Perkin Elmer) (8Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (265) Google Scholar). Colloidal chitin was prepared as described by Shimahara and Takiguchi (18Shimahara K. Takiguchi Y. Methods Enzymol. 1988; 166: 417-423Crossref Scopus (179) Google Scholar). SDS-PAGE was performed with a Amersham Pharmacia Biotech phast gel system, according to the instructions of the manufacturer, using 12.5‥ polyacrylamide gels, followed by silver staining. Glycol-chitin electrophoresis was conducted as described by Escott and Adams (19Escott G.M. Adams D.J. Infect. Immun. 1995; 63: 4770-4773Crossref PubMed Google Scholar), except for an extension of the renaturation time to 8 h. Glycol-chitin was prepared from glycol chitosan (Sigma) as described by Trudel and Asselin (20Trudel J. Asselin A. Anal. Biochem. 1989; 178: 362-366Crossref PubMed Scopus (479) Google Scholar). The native isoelectric point of chitinases was determined by flat bed isoelectric focusing in granulated Ultrodex gels (Amersham Pharmacia Biotech) as described (8Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (265) Google Scholar). Total RNA was isolated using RNAzol B (Biosolve, Barneveld, The Netherlands) according to the instructions of the manufacturer. Northern blots, using 15 μg of total RNA, were performed as described (9Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar). Human and mouse RNA Master Blots (CLONTECH, Palo Alto, CA) were used to examine the tissue distribution of transcripts according to the instructions of the manufacturer. The following probes were used: the full-length mouse acidic chitinase cDNA, the human EST clone oq35c04.s1 (GenBankTM accession number AA976830) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as control. Radiolabeling and hybridization was conducted as described previously (9Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar). Quantification of radioactivity was performed using a PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) fragments were generated from mouse lung total RNA using degenerate oligonucleotides, as described (9Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar). Obtained fragments were cloned in pGEM-T (Promega, Madison, WI), sequenced, and compared with the amino acid sequence established by N-terminal protein sequencing. A comparison with the GenBankTM mouse EST (expressed sequence tag) data base using the Basic local alignment search tool (BLAST) at the National Center for Biotechnology Information showed that several EST clones matched the mouse chitinase cDNA sequence, for example, ms33 h09.y1 (GenBankTM accession number AI892792). This clone was obtained and sequenced. Antisense primers were generated complementary to the most 3′ region of the EST clone (A tail primer, 5′-TTTTGGCTACCAATTTTATTGC-3′) and two internal antisense primers (MAS1, 5′-CAGCTACAGCAGCAGTAACCATC-3′ and MAS2, 5′-TTCAGGGATCTCATAGCCAGC-3′). The MAS1 and MAS2 primers were used to clone the most 5′ end of the mouse acidic chitinase cDNA using 5′ rapid amplification of cDNA ends and the Marathon-Ready mouse Lung cDNA kit (CLONTECH) according to the instructions of the manufacturer. To obtain the complete coding sequence a 5′ sense primer was generated (MS1, 5′-CGATGGCCAAGCTACTTCTCGT-3′). The total cDNA sequence was subsequently generated using MS1 and the A tail primer. The fragments of two independent PCRs were cloned into pGEM-T (Promega), and the nucleotide sequences of two independent clones from each PCR were sequenced from both strands by the procedure of Sanger using fluorescent nucleotides on an Applied Biosystems 377A automated DNA sequencer following Applied Biosystems protocols. Comparison of the mouse AMCase cDNA sequence with the human EST data base (National Center for Biotechnology Information) revealed the presence of a human EST clone oq35c04.s1 (GenBankTM accession number AA976830) highly homologous to the mouse acidic chitinase. Following the same strategy, the full-length human AMCase cDNA was cloned using human stomach total RNA (CLONTECH) for the reverse transcription PCR with the same degenerate primers. A human Marathon-Ready Lung cDNA was used to clone the most 5′ end of the cDNA by 5′ rapid amplification of cDNA ends using the following primers: HAS2 (5′-TCTGACAGCACAGAATCCACTGCC-3′) and HAS3-A tail (5′-TTGACTGCTGATTTTATTGCAG-3′). The total cDNA sequence was subsequently generated using HS1 (5′-GCTTTCCAGTCTGGTGGTGAAT-3′) and HAS3-A tail. The fragments of two independent PCRs were cloned in pGEM-T (Promega) and sequenced as described above. Transient expression of the various cDNAs in COS-1 cells was performed exactly as described previously (9Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar). To obtain more insight into the potential occurrence of multiple mammalian chitinases, tissues of mouse and rat were examined for chitinolyic activity using the chitin-like 4-methylumbelliferyl-β-chito-oligosaccharide substrates. In extracts of stomach and intestine, a high level of activity was detected, whereas extracts of lung, tongue, kidney, and plasma showed significant but lower activities. Isoelectric focusing of a mouse lung extract revealed a major peak of chitinolytic activity with pI of 4.5, whereas minor peaks were found with pI levels of 5.5–6.5 (Fig.1). Extracts of other mouse and rat tissues showed similar profiles of chitinolytic activity upon isoelectric focusing. The observed rodent chitinase with acidic isoelectric point (pI 4.5 form) differs strikingly from human chitotriosidase which has an apparent neutral/basic pI. The mouse acidic chitinase activity was found to bind to chitin particles with high affinity. Chitin affinity chromatography was used to purify the enzyme, as described under “Experimental Procedures.” The procedure resulted in a 30,000-fold purification of an apparently homogeneous 50-kDa protein. The specific activity of the purified enzyme was 3.9 nmol of 4-methylumbelliferyl-chitotrioside hydrolyzed per mg per hour at pH 5.2, which is almost identical to that of human chitotriosidase. The N-terminal amino acid sequence of purified acidic chitinase was determined (Fig. 2) and was found to be almost identical to that of other known members of the chitinase family. This amino acid sequence allowed the cloning of the corresponding full-length mouse acidic chitinase cDNA, as described under “Experimental Procedures.” The full-length cDNA predicts the synthesis of a 50-kDa (pI 4.85) protein with a characteristic signal peptide (Fig. 2). Expression of this cDNA in COS-1 cells led to the secretion of an 50-kDa active chitinase with a pI of 4.8. The mouse acidic chitinase protein shows considerable sequence homology to human chitotriosidase. Comparison of the amino acid sequence of both mature proteins revealed an identity of 52‥ and a similarity of 60‥. Like the human chitotriosidase, the mouse enzyme is predicted to contain an N-terminal catalytic domain of about 39 kDa, a hinge region, and a C-terminal chitin binding domain (Fig. 2). The mouse acidic chitinase, like chitotriosidase, is predicted to lackN-linked oligosaccharides, explaining the observed absence of binding to concanavalin A (data not shown). Several different assays revealed that the mouse acidic chitinase is able to degrade chitin and therefore has to be considered to be a true chitinase. Firstly, fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis analysis revealed that recombinant mouse chitinase, like chitotriosidase, releases mainly chitobioside fragments from chitin (Fig. 3). Secondly, like chitotriosidase and some other nonmammalian chitinases, the mouse acidic chitinase is strongly inhibited (IC50 of 0.4 μm) by the competitive chitinase inhibitor allosamidin (21Milewski S. O'Donnel R.W. Gooday G.W. J. Gen. Microbiol. 1992; 138: 2545-2550Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar, 22Dickinson K. Keer V. Hitchcock C.A. Adams D.J. J. Gen. Microbiol. 1989; 135: 1417-1421PubMed Google Scholar, 23McNab R. Glover L.A. FEMS Microbiol. Lett. 1991; 82: 79-82Crossref Scopus (19) Google Scholar). Finally, the mouse acidic chitinase and chitotriosidase were both able to digest chitin in the cell wall of regenerating spheroplasts of C. albicans. The chitin content of the cell wall was determined with the Calcofluor white stain (see “Experimental Procedures”). When regenerating cells were incubated for 2 h with 3 μg/ml recombinant chitotriosidase or 3 μg/ml recombinant mouse acidic chitinase, the chitin content was reduced by 27 and 33‥, respectively. Concomitant presence of allosamidin during the incubation completely abolished the effect of both recombinant chitinases. The apparent molecular masses of identically produced recombinant human chitotriosidase and recombinant mouse acidic chitinase are comparable when run on a SDS-PAGE gel under reducing conditions. However, under nonreducing conditions, the mouse acidic chitinase migrates significantly slower than the human chitotriosidase (Fig.4 A). Upon gelelectrophoresis (under nonreducing conditions) in polyacrylamide gels containing glycolchitin, followed by regeneration of active enzyme and detection of the local digestion of glycolchitin using Calcofluor staining, the mouse acidic chitinase migrates slightly faster than human chitotriosidase (Fig. 4 B). A further striking difference between human chitotriosidase and the mouse acidic chitinase is their behavior at acidic pH. The mouse acidic chitinase shows a pronounced pH optimum at pH 2.3 and a less pronounced optimum at more neutral pH (pH 4–7). Chitotriosidase, however, shows only a broad pH optimum (Fig.5 A) and is completely inactivated by pre-incubation at low pH (Fig. 5 B). In the presence of 0.5‥ (w/v) trichloroacetic acid 58‥ of chitotriosidase is precipitated, whereas under similar circumstances the mouse acidic chitinase remains in solution. At 2.5‥ (w/v) trichloroacetic acid all chitotriosidase precipitates, whereas 26‥ of mouse acidic chitinase remains unprecipitated (Fig. 5 C). Another major difference between human chitotriosidase and the mouse acidic chitinase is revealed by comparison of RNA expression patterns. Although human chitotriosidase mRNA is mainly found in lymph node, bone marrow, and lung, the mouse acidic chitinase mRNA is predominantly found in stomach, submaxillary gland, and, at a lower level, in the lung (Fig. 6). Surprisingly, no mouse acidic chitinase mRNA can be detected in the small intestine, suggesting that the protein in the intestine is probably derived from the upper parts of the gastrointestinal tract, such as the stomach. In rat tissues a comparable acidic chitinase was observed. Our findings indicate that the acidic chitinase in rodents is distinct from human chitotriosidase. The discrete enzyme is therefore referred to as acidic mammalian chitinase or AMCase. It was investigated whether such an acidic chitinase is also present in man. Screening the human EST data base at the National Center for Biotechnology Information with the mouse acidic chitinase cDNA revealed the presence of a highly homologous human EST clone (oq35c04.s1, GenBankTM accession number AA976830). The tissue distribution of this human mRNA was examined using a human Masterblot (CLONTECH). The expression pattern of this mRNA is similar to the expression pattern of the mouse acidic chitinase (Fig.7), being highly expressed in the stomach and at a lower level in the lung. Using degenerate oligonucleotides directed against members of the chitinase family, we were able to amplify other regions of the human acidic chitinase, generating enough information to clone the full-length human acidic chitinase cDNA (Fig. 8 A). Screening the GenBankTM data base using the full-length human cDNA revealed that it was almost identical to TSA1902-L (GenBankTM accession number AB025008) and TSA1902-S (GenBankTM accession number AB025009) from a lung cDNA library described by Saito et al. (24Saito A. Ozaki K. Fujiwara T. Nakamura Y. Tanigami A. Gene (Amst.). 1999; 239: 325-331Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). These two sequences are most probably splice variants of the human acidic chitinase mRNA. Only expression of full-length human AMCase cDNA in COS-1 cells led to the production of a protein with chitinolytic activity (data not shown). Sequence comparison of the human acidic chitinase and the mouse acidic chitinase revealed an 82‥ identity and a similarity of 86‥ (Fig. 8 B).Figure 8Human AMCase cDNA sequence and deduced amino acid sequence. A, the human AMCase cDNA sequence (GenBankTM accession number AF290004) is indicated by the upper sequence, and the deduced amino acid sequence is indicated below the nucleotide sequence. The characteristic hydrophobic signal peptide (amino acids 1–21) isunderlined with a single line. B, amino acid sequence comparison of mature (without signal peptide) human (h) and mouse (m) AMCase and human chitotriosidase. Residues conserved among at least two out of the three sequences are boxed.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) The demonstration by Saito et al. (24Saito A. Ozaki K. Fujiwara T. Nakamura Y. Tanigami A. Gene (Amst.). 1999; 239: 325-331Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar) that the gene encoding TSA1902 is located on chromosome 1p13 indicates that mammals contain indeed at least two discrete genes that encode functional chitinases, being chitotriosidase (locus 1q32) and AMCase (locus 1p13). Definitive proof for the existence of at least two distinct, functional mammalian chitinase genes was recently obtained by the partial cloning of chitotriosidase cDNA from the rat. The cloned rat cDNA (80‥ of the complete cDNA) encodes a protein that is 80‥ identical to the human counterpart. For many years the existence of chitinase has been well documented for a large variety of organisms, including bacteria, plants, insects, and fungi (for an overview see Ref. 6Flach J. Pilet P.E. Jolles P. Experientia. 1992; 48: 701-716Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar). More recently, it has become clear that mammals also contain such enzymes. Chitotriosidase was the first mammalian chitinase that had been cloned and characterized (7Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (748) Google Scholar, 8Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (265) Google Scholar, 9Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (337) Google Scholar). Besides this human phagocyte-specific chitinase, several inactive members of the mammalian chitinase protein family have also been identified. These include oviduct-specific glycoprotein from several mammalian species (reviewed in Refs. 25Boatman D.E. Hum. Reprod. 1997; 12: 133-149PubMed Google Scholar, 26Verhage H.G. Fazleabas A.T. Mavrogianis P.A. O'Day-Bowman M.B. Donnelly K.M. Arias E.B. Jaffe R.C. Hum. Reprod. Update. 1997; 3: 541-552Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar, 27Malette B. Paquette Y. Merlen Y. Bleau G. Mol. Reprod. Dev. 1995; 41: 384-397Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar), human HC gp39/YKL-40 (28Hakala B.E. White C. Recklies A.D. J. Biol. Chem. 1993; 268: 25803-25810

The human chitinase, named chitotriosidase, is a member of family 18 of glycosylhydrolases. Following the cloning of the chitotriosidase cDNA (Boot, R. G., Renkema, G. H., Strijland, A., van Zonneveld, A. J., and Aerts, J. M. F. G. (1995) J. Biol. Chem. 270, 26252–26256), the gene and mRNA have been investigated. The chitotriosidase gene is assigned to chromosome 1q31-q32. The gene consists of 12 exons and spans about 20 kilobases. The nature of the common deficiency in chitotriosidase activity is reported. A 24-base pair duplication in exon 10 results in activation of a cryptic 3′ splice site, generating a mRNA with an in-frame deletion of 87 nucleotides. All chitotriosidase-deficient individuals tested were homozygous for the duplication. The observed carrier frequency of about 35% indicates that the duplication is the predominant cause of chitotriosidase deficiency. The presence of the duplication in individuals from various ethnic groups suggests that this mutation is relatively old. The human chitinase, named chitotriosidase, is a member of family 18 of glycosylhydrolases. Following the cloning of the chitotriosidase cDNA (Boot, R. G., Renkema, G. H., Strijland, A., van Zonneveld, A. J., and Aerts, J. M. F. G. (1995) J. Biol. Chem. 270, 26252–26256), the gene and mRNA have been investigated. The chitotriosidase gene is assigned to chromosome 1q31-q32. The gene consists of 12 exons and spans about 20 kilobases. The nature of the common deficiency in chitotriosidase activity is reported. A 24-base pair duplication in exon 10 results in activation of a cryptic 3′ splice site, generating a mRNA with an in-frame deletion of 87 nucleotides. All chitotriosidase-deficient individuals tested were homozygous for the duplication. The observed carrier frequency of about 35% indicates that the duplication is the predominant cause of chitotriosidase deficiency. The presence of the duplication in individuals from various ethnic groups suggests that this mutation is relatively old. 4,6-diamidino-2-phenylindole polymerase chain reaction base pair(s) kilobase(s) 1,4-piperazinediethanesulfonic acid. A chitinase in man has been documented only recently (1Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (760) Google Scholar, 2Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (269) Google Scholar, 3Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). The enzyme was detected initially on the basis of its capacity to hydrolyze artificial chitotrioside substrates and was therefore named chitotriosidase (1Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (760) Google Scholar). Chitotriosidase is synthesized by activated macrophages (1Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (760) Google Scholar). In plasma and tissues of patients suffering from Gaucher disease, chitotriosidase activity is markedly elevated because of its massive production and secretion by the lipid-laden macrophages that accumulate in these patients (1Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (760) Google Scholar, 4Barranger J.A. Ginns E.I. The Metabolic Basis of Inherited Disease. McGraw-Hill Inc., New York1989: 1677-1698Google Scholar). Purification of chitotriosidase and cloning of the corresponding cDNA have revealed that the enzyme belongs to the family 18 of glycosylhydrolases and shares significant sequence identity to chitinases from various nonmammalian species (3Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar, 5Henrissat B. Bairoch A. Biochem. J. 1993; 293: 781-788Crossref PubMed Scopus (1771) Google Scholar). The enzyme is capable of degrading chitin and should be considered as the human chitinase analogue (2Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (269) Google Scholar). The established antifungal action of homologous chitinases in plants and the tightly regulated expression of chitotriosidase in phagocytes suggest that chitotriosidase might fulfill a role in degradation of chitin-containing pathogens (6Collinge D.B. Kragh K.M. Mikkelsen J.D. Nielsen K.K. Rasmussen U. Vad K. Plant J. 1993; 3: 31-40Crossref PubMed Scopus (775) Google Scholar, 7Flach J. Pilet P.E. Jolles P. Experientia (Basel). 1992; 48: 701-716Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar). Recently, a number of other human members of the chitinase protein family have been identified: oviductin (human oviduct specific glycoprotein), human cartilage glycoprotein 39 (HCgp-39), and YKL39 (8Arias E.B. Verhage H.G. Jaffe R.C. Biol. Reprod. 1994; 51: 685-694Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar, 9Hakala B.E. White C. Recklies A.D. J. Biol. Chem. 1993; 268: 25803-25810Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 10Hu B. Trinh K. Figueira W.F. Price P.A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 19415-19420Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (169) Google Scholar). In contrast to chitotriosidase, these proteins have no known enzymatic activity, and their function is so far not precisely understood. Chitotriosidase in human tissue is heterogeneous with respect to its isoelectric point and molecular mass. The major isoform shows a molecular mass of 50 kDa and a heterogeneous pI of 5.0–7.2. The minor isoform has a mass of 39 kDa and a discrete pI of 8.1 (2Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (269) Google Scholar). The amino termini of both isoforms are identical and exactly as predicted by the cloned chitotriosidase cDNA that codes for a 50-kDa protein. Metabolic labeling experiments with cultured macrophages have revealed that a 50-kDa chitotriosidase is initially synthesized and subsequently undergoes posttranslational modification. First, O-linked glycosylation of the carboxyl-terminal part of the protein generates the heterogeneity in charge. Second, whereas most 50-kDa enzyme is secreted, part of it is intracellularly converted by carboxyl-terminal proteolytic processing into the 39-kDa isoform that accumulates in lysosomes (11Renkema G.H. Boot R.G. Strijland A. Donker-Koopman W.E. Van Den Berg M. Muijsers A.O. Aerts J.M.F.G. Eur. J. Biochem. 1997; 244: 279-285Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). It has recently been noted that the carboxyl-terminal domain of 50-kDa chitotriosidase mediates the strong binding of this enzyme to chitin, a feature that is not shown by the 39-kDa enzyme (11Renkema G.H. Boot R.G. Strijland A. Donker-Koopman W.E. Van Den Berg M. Muijsers A.O. Aerts J.M.F.G. Eur. J. Biochem. 1997; 244: 279-285Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). A recessively inherited deficiency in chitotriosidase activity is frequently encountered (1Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (760) Google Scholar). For example, in The Netherlands about 1 in 20 individuals is completely deficient in enzymatically active chitotriosidase in all materials tested, including plasma, urine, cultured macrophages, leukocytes, and tissues (1Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (760) Google Scholar, 12Guo Y.F. He W. Boer A.M. Wevers R.A. Debruijn A.M. Groener J.E.M.M. Hollak C.E.M. Aerts J.M.F.G. Galjaard H. Van Diggelen O.P. J. Inherited Metab. Dis. 1995; 18: 717-722Crossref PubMed Scopus (185) Google Scholar). Because there are no indications for the presence of enzyme inhibitors in these individuals, it is most likely that some mutation in the chitotriosidase gene underlies the enzyme deficiency. To obtain further insight in the molecular basis of the chitotriosidase deficiency, we have investigated the composition of the chitotriosidase gene and the corresponding mRNA of control and enzyme-deficient individuals. The results of this study are here described and discussed. All reagents were obtained from Sigma unless indicated otherwise. Peripheral blood monocytes were isolated and cultured for a prolonged time in the presence of human AB serum during which process spontaneous differentiation into macrophages occurs (1Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (760) Google Scholar). After 7–14 days of culture, cells were used in experiments. Cultured macrophages or transfected COS cells were incubated for 10 min in the presence of radioactive methionine and subsequently chased in the presence of excess unlabeled amino acid. Radiolabeled chitotriosidase was specifically visualized using a rabbit anti-(chitotriosidase) antiserum exactly as described before (2Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (269) Google Scholar, 11Renkema G.H. Boot R.G. Strijland A. Donker-Koopman W.E. Van Den Berg M. Muijsers A.O. Aerts J.M.F.G. Eur. J. Biochem. 1997; 244: 279-285Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). Binding of chitotriosidase to chitin was analyzed by incubation of enzyme containing samples with chitin particles (Sigma), followed by centrifugation. A macrophage cDNA library, was screened using the partial chitotriosidase cDNA probe (3Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). Positive cDNA clones were sequenced double-stranded using the dideoxy-nucleotide chain termination method with T7 DNA polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) and appropriate primers as described (3Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar, 13Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar, 14Sanger F. Nicklen S. Coulson A.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1977; 74: 5463-5467Crossref PubMed Scopus (52678) Google Scholar). Total macrophage RNA was isolated using the RNAzol B RNA isolation kit according to the instructions of the manufacturer (Biosolve, Barneveld, The Netherlands). For Northern blot analysis, 15-μg samples of total RNA were electrophoresed in 10 mm Hepes, 6% formaldehyde-agarose gels, transferred to Hybond N nylon membranes (Amersham, UK) by the capillary method and immobilized by UV cross-linking. The following probes were used: total chitotriosidase cDNA and mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase as an RNA control. The probes were radiolabeled with 32P using the random priming method (13Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar). Hybridization conditions were exactly as described before (3Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). A human genomic library (Imperial Cancer Research Fund (ICRF), Reference Library (library no. 700 P1 Human, host NS3145, vector pAd10SacBII (15Lehrach H. Drmanac R. Hoheisel J. Larin Z. Lennon G. Monaco A.P. Nizetic D. Zehetner G. Poustka A. Genome Analysis Volume 1: Genetic and Physical Mapping. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1990: 39-81Google Scholar)) was screened using the full-length 32P-labeled chitotriosidase cDNA probe. Duplicate filters were used in the screening procedure to avoid false results. The hybridization conditions were exactly as described before (3Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). The coordinates of the positive spots on the filters were determined, and the genomic clone (ICRFP700O0516) containing the chitotriosidase gene was obtained from the ICRF. The genomic clone was digested with different restriction enzymes, and the smaller fragments, containing exons, were subcloned in the plasmid vectors pGEM-7Zf(+) (Promega, Madison, WI) or pUC19 (New England Biolabs Inc.). Sequence analysis on the plasmid subclones was performed as described above, using several primers specific for the chitotriosidase cDNA. The obtained genomic chitotriosidase clone of about 110 kb was biotinylated by nick translation according to the specifications of the manufacturers (Life Technologies, Inc.). High resolution chromosomes from peripheral blood lymphocytes were obtained according to standard techniques. Fluorescentin situ hybridization (FISH) was performed using the biotinylated genomic clone and fluorescein isothiocyanate-conjugated avidin, exactly as described before (16Hoovers J.M.N. Mannens M.M.A.M. John R. Bliek J. van Heyningen V. Porteous D.J. Leschot N.J. Westerveld A. Little P.F.R. Genomics. 1992; 12: 254-263Crossref PubMed Scopus (144) Google Scholar). For chromosome identification and probe localization, metaphases were simultaneously Q-banded using DAPI1/actinomycin D, as described (17Wiegant J. Galjart N.J. Raap A.K. D'Azzo A. Genomics. 1991; 10: 345-349Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar). To generate the desired RNase protection probe, a polymerase chain reaction (PCR) fragment of chitotriosidase (216 bp), was ligated into the EcoRV site of pGEM-5Zf(+) (Promega). To determine the orientation and to exclude the existence of PCR artifacts, this construct was sequenced. The plasmid was then linearized with NdeI and size fractionated on an agarose gel, and the appropriate fragment was isolated. The protection riboprobe (298 nucleotides) was generated using this DNA template, T7 RNA polymerase (Stratagene), and [32P]UTP. After in vitro transcription, the RNA was purified by electrophoresis on a 5% polyacrylamide, 7 m urea, TBE (0.09 m Tris borate, 0.002 m EDTA, pH 8.0) gel, and the appropriate band was isolated (13Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar, 18Jonk L.J.C. de Jonge M.E.J. Kruyt F.A.E. Mummery C.L. van der Saag P.T. Kruijer W. Mech. Dev. 1992; 36: 165-172Crossref PubMed Scopus (52) Google Scholar). For RNase protection, 5 μg of total macrophage RNA was hybridized overnight at 42 °C with 105 cpm of labeled probe in 20 μl of 80% formamide, 400 mm NaCl, 40 mmPIPES, pH 6.4, 1 mm EDTA. Following hybridization, single-stranded RNA was digested in 350 μl of 10 mmTris-HCl, pH 7.5, 300 mm NaCl, 5 mm EDTA, 1 μg/ml RNase T1 (1300 units/μg, Life Technologies, Inc.) for 60 min at 37 °C. Next, RNA was purified by Proteinase K digestion, phenol/chloroform/isoamylalcohol extraction, and ethanol precipitation. Finally, RNA was visualized by autoradiography after electrophoresis on a 5% polyacrylamide, 7 m urea, TBE gel (13Sambrook J. Fritsch E.F. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1989Google Scholar, 18Jonk L.J.C. de Jonge M.E.J. Kruyt F.A.E. Mummery C.L. van der Saag P.T. Kruijer W. Mech. Dev. 1992; 36: 165-172Crossref PubMed Scopus (52) Google Scholar). Sequence analysis of cDNA clones, genomic clone and subclones, was performed using Mac Vector 4.1.1 and the Genetics Computing Group package (version 7.0). Sequence comparisons and multiple sequence alignments were performed using the sequence alignment programs PILEUP, BESTFIT, and GAP. Transient transfection of COS-1 cells by the DEAE-dextran method was performed essentially as described in Ref. 19Lopata M.A. Cleveland D.W. Sollner-Webb B. Nucleic Acids Res. 1984; 12: 5707-5717Crossref PubMed Scopus (518) Google Scholar. The activity of chitotriosidase was measured using the fluorogenic substrate 4-methylumbelliferyl β-d-N, N′,N"-triacetylchitotriose exactly as described before (1Hollak C.E.M. van Weely S. van Oers M.H.J. Aerts J.M.F.G. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1288-1292Crossref PubMed Scopus (760) Google Scholar). A rabbit antiserum was raised against 39-kDa chitotriosidase purified from human spleen. This antiserum is able to inhibit human chitotriosidase in enzymatic activity (2Renkema G.H. Boot R.G. Muijsers A.O. Donker-Koopman W.E. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 2198-2202Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (269) Google Scholar). Immunotitrations were carried out as follows. Enzyme-containing samples were preincubated for 30 min with different amounts of antiserum, and subsequently enzyme activity was determined in the samples. For these experiments, medium from transfected COS cells was collected and cells were harvested by trypsinization. Cells were homogenized by sonication in 0.25% (v/v) Triton X-100, 50 mm potassium phosphate buffer (pH 6.5). The homogenate was centrifuged and the supernatant collected. As a control enzyme preparation, an extract of Gaucher spleen was prepared by addition of 5 volumes of H2O and homogenization with an Ultraturrax (Janke & Kunkel, Staufen, Germany). The supernatant obtained after centrifugation was collected. From harvested macrophages, total RNA was isolated and single-stranded cDNA was prepared from the total macrophage RNA using reverse transcriptase and oligo(dT) as described before (3Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). To obtain the complete open reading frame of chitotriosidase, PCR was carried out using the single-stranded cDNA as template as described before (3Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). The primers used are: Chs1, 5′-CTGCATCATGGTGCGGTC-3′; and Chas1, 5′-GAAGGCAAGGCTGAGAGC-3′ (see Fig. 3 B). The PCR products were subsequently cloned in the pGEM-T vector (Promega). Sequence analysis of the cloned PCR products was performed exactly as described above. Genomic DNA was isolated from leukocytes, and 300 ng of this genomic DNA was used as template in subsequent PCR reactions. The following primers were employed: Chs8, 5′-TACATCTTCCGGGACAAC-3′; and Chas9, 5′-TCAGTTCCTGCCGTAGCGTC-3′. PCR fragments were cloned in the pGEM-T vector and sequenced as described above. Using specific primers (Chs9, 5′-AGCTATCTGAAGCAGAAG-3′; and Chas8, 5′-GGAGAAGCCGGCAAAGTC-3′, see Fig. 4) fragments of 75 and 99 bp are amplified from the normal and mutant chitotriosidase gene, respectively, when present in genomic DNA. Electrophoresis in a native 10% acrylamide gel allows the detection of both fragments. In the case of carriers for the duplication, a mixture of both fragments is detected. A genomic clone containing the chitotriosidase gene was isolated (clone ICRFP700O0516 of the Imperial Cancer Research Fund Reference Library (15Lehrach H. Drmanac R. Hoheisel J. Larin Z. Lennon G. Monaco A.P. Nizetic D. Zehetner G. Poustka A. Genome Analysis Volume 1: Genetic and Physical Mapping. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1990: 39-81Google Scholar)), as described under “Materials and Methods.” To allow sequence analysis, the genomic clone of about 110 kb was subcloned into smaller fragments using HindIII and BamHI restriction enzymes. The exon/intron composition of the chitotriosidase gene was determined by sequencing of genomic plasmid subclones and comparison of the information with the sequence of the chitotriosidase cDNA. As shown in Fig. 1, the gene was found to be composed of 12 exons and spans about 20 kb of genomic DNA. Exon 1 was defined as containing the first nucleotide of the longest chitotriosidase cDNA; the exact transcription start site has not been accurately mapped. The sizes of the exons range from 30 to 461 bp. The sizes of the smaller introns were determined by sequencing, and those of the larger ones were estimated by electrophoresis of fragments generated either by PCR or restriction enzyme digestion (Table I). In all cases, the sequences of the intron/exon borders are compatible with consensus splice site sequences (20Breathnach R. Chambon P. Annu. Rev. Biochem. 1981; 50: 349-383Crossref PubMed Scopus (3297) Google Scholar).Table ISequences of the exon/intron junctions of the human chitotriosidase geneExon 1Intron 1Exon 2TG.GCC.TGG.GCA.Ggtgagccgtcgg …(∼1200 bp)… gtgttgctccagGT.TTC.ATG.GTC.CExon 2Intron 2Exon 3TG.ATC.CCA.TGG.Ggtaagtagcctc …(∼2300 bp)… ccaacgggccagGC.TCT.GCT.GCA.AExon 3Intron 3Exon 4C.CTG.AAG.AAG.ATgtgagccaaagc …(∼500 bp)… tgtctttcccagG.AAT.CCC.AAG.CTExon 4Intron 4Exon 5C.GGC.ACT.CAG.AAgttagttgactg …(∼1300 bp)… atcacctcacagG.TTC.ACA.GAT.ATExon 5Intron 5Exon 6.CCC.TGG.GTA.CAGgtatggctgggc …(232 bp)… ccactcccacagGAC.TTG.GCC.AAT.Exon 6Intron 6Exon 7C.AAA.ATC.GCC.CA gtgagtctcagg …(∼900 bp)… tgcctcctgcagG.AAC.CTT.GGA.TTExon 7Intron 7Exon 8.AGC.CTC.AAC.GTGgtacgtgtggca …(∼2500 bp)… ctcttccaccagGAT.GCT.GCT.GTG.Exon 8Intron 8Exon 9.GCC.TAC.TAT.GAAgtaggaaaaccc …(∼350 bp)… ctgctcccacagGTC.TGC.TCC.TGG.Exon 9Intron 9Exon 10.TTC.AAA.ACC.AAGgtgaggcccagc …(∼1300 bp)… ctccctgcacagGTC.AGC.TAT.CTG.Exon 10Intron 10Exon 11GG.CAG.GAA.CTG.Agtaagtaagggg …(364 bp)… ttgtgcttgcagAT.GGG.TAA.AGC.CExon 11Intron 11Exon 12.CTT.CAG.CTG.TAG gtatggctgttg …(167 bp)… ctgtcttcccagGT.CTT.CCA.TAC.TExon sequences are shown in uppercase and the intron sequences in lowercase letters. The reading frame of the cDNA sequence is indicated. Splice-donor and -acceptor sites are shown in bold. The length of each intron is shown in parentheses. The alternative exon (11Renkema G.H. Boot R.G. Strijland A. Donker-Koopman W.E. Van Den Berg M. Muijsers A.O. Aerts J.M.F.G. Eur. J. Biochem. 1997; 244: 279-285Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar) is underlined. Open table in a new tab Exon sequences are shown in uppercase and the intron sequences in lowercase letters. The reading frame of the cDNA sequence is indicated. Splice-donor and -acceptor sites are shown in bold. The length of each intron is shown in parentheses. The alternative exon (11Renkema G.H. Boot R.G. Strijland A. Donker-Koopman W.E. Van Den Berg M. Muijsers A.O. Aerts J.M.F.G. Eur. J. Biochem. 1997; 244: 279-285Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar) is underlined. The 71-bp exon 11 can be alternatively spliced (Fig. 1). This exon is usually skipped in the splicing process, generating the predominant mRNA species encoding the 50-kDa protein. In macrophages also, a distinct mRNA is rarely formed as the result of a lack of exon 11 skipping. Since exon 11 introduces a premature stop codon, the alternatively spliced mRNA encodes a 40-kDa chitotriosidase that is almost identical to the 39-kDa isoform generated by proteolytic processing of the 50-kDa chitotriosidase (11Renkema G.H. Boot R.G. Strijland A. Donker-Koopman W.E. Van Den Berg M. Muijsers A.O. Aerts J.M.F.G. Eur. J. Biochem. 1997; 244: 279-285Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). Fluorescent in situ hybridization with the genomic clone as probe was used to assign the chromosomal locus for the chitotriosidase gene, as described under “Materials and Methods.” Fig. 2 shows that the chitotriosidase gene is located on chromosome 1q31–1q32. Cultured macrophages of enzyme-deficient individuals do not produce enzymatically active chitotriosidase. Metabolic labeling experiments showed that only minor amounts of a short-lived 47-kDa chitotriosidase are synthesized (not shown). Northern blot analysis revealed that these macrophages do contain some chitotriosidase RNA although in markedly reduced amounts (Fig. 3 A). From macrophage RNA of two control subjects and two unrelated chitotriosidase-deficient individuals, chitotriosidase cDNAs containing the complete open reading frame were generated using reverse transcription-PCR. Sequencing showed that these cDNAs were completely identical with the exception of a deletion of 87 nucleotides in exon 10 of the mutant RNA (Fig. 3 B). The abnormal mRNA codes for a protein that lacks amino acids 344–372, a highly conserved region in members of the chitinase protein family (Fig. 3 B, and Ref. 3Boot R.G. Renkema G.H. Strijland A. van Zonneveld A.J. Aerts J.M.F.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 26252-26256Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (339) Google Scholar). Transfection of COS-1 cells with wild-type chitotriosidase cDNA resulted in secretion of enzymatically active 50-kDa chitotriosidase, whereas parallel transfection with mutant cDNA led to modest synthesis of a 47-kDa protein that was largely intracellularly degraded, as was seen for cultured macrophages. The recombinant protein that could be isolated showed no capacity to degrade chitin or artificial substrates. It was, however, still able to bind to chitin particles. To establish the precise molecular defect, genomic DNA of control subjects and chitotriosidase-deficient individuals was studied. Relevant parts of the mutant gene were amplified by PCR using appropriate primers (Fig. 4 A, and under “Material and Methods”). Sequence analysis revealed that in exon 10 of the mutant gene a 24-nucleotide duplication is present (Fig. 4 A). Apparently, this duplication leads to the selection of a cryptic 3′ splice site downstream in the exon, although the authentic splice site is still intact in the mutant chitotriosidase gene. Consistent with the findings made for macrophages of control subjects and chitotriosidase-deficient individuals (shown in Fig. 3 A), RNase protection assays revealed that macrophages of heterozygotes contain only a very small amount of mutant mRNA as compared with wild-type mRNA. These reduced levels of steady state chitotriosidase mRNA could be due to two different reasons: (i) reduced transcription of the mutant gene, and/or (ii) production of mRNA that is unstable relative to wild-type chitotriosidase mRNA. Attempts to determine half-life of mRNA following actinomycin-D treatment were so far unsuccessful because of its apparent lability. The presence of the 24-bp duplication in the chitotriosidase gene can be detected by PCR of genomic DNA with specific primers (Fig. 4 B, and “Material and Methods”). Fragments of 75 and 99 bp are amplified from the normal and mutant gene, respectively. All chitotriosidase-deficient individuals examined so far (n = 26) were homozygous for the 24-bp duplication in the chitotriosidase gene. Table II shows the results of the analysis of chitotriosidase genotype of Ashkenazi Jewish and Dutch individuals. It can be seen that the incidence of homozygotes and heterozygotes for the duplication was about 6 and 35%, respectively, in both populations. The same mutation has presently been detected in individuals with European (including Dutch) (n = 326), Jewish (n = 68), African (n = 10), and Asian (n = 20) ancestry. A study on Indonesian individuals has indicated that the incidence of enzyme deficiency is also about 6% in this ethnic group. Genotyping of Indonesian subjects showed that again about one in every three individuals is a carrier for 24-bp duplication in the chitotriosidase gene.Table IIChitotriosidase genotype distributionPopulationGenotypeWild-typeHeterozygote mutantHomozygote mutant%Dutch (n = 171)58.535.16.4Ashkenazi Jewish (n = 68)60.333.85.9The chitotriosidase genotype of unrelated Ashkenazi Jewish and Dutch subjects was determined as described under “Materials and Methods.” Open table in a new tab The chitotriosidase genotype of unrelated Ashkenazi Jewish and Dutch subjects was determined as described under “Materials and Methods.” Our investigation of the features of the chitotriosidase gene and its RNA has been informative in a number of respects. First, the established exon composition of the chitotriosidase gene points out the striking similarity of the organization of this gene with that of other human genes coding for members of the chitinase protein family. The exon/intron boundaries in the genes of the human oviduct glycoproteins YKL-39 and of HCgp-39 are very similarly located (Refs.8Arias E.B. Verhage H.G. Jaffe R.C. Biol. Reprod. 1994; 51: 685-694Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar, 10Hu B. Trinh K. Figueira W.F. Price P.A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 19415-19420Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (169) Google Scholar, and 21Rehli M. Krause S.W. Andreesen R. Genomics. 1997; 43: 221-225Crossref PubMed Scopus (235) Google Scholar, and GenBank accession numbers U58001–U58010, U58514,U58515, and U49835). This suggests that these genes have evolved by duplication events. The locus of the chitotriosidase gene was assigned to 1q31–32 using fluorescent in situ hybridization with the genomic clone as probe. During the preparation of the manuscript, Eiberg and Den Tandt (22Eiberg H. Den Tandt W.R. Hum. Genet. 1997; 101: 205-207Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar) independently mapped the gene to 1q31-qter by linkage analysis. The genes of all the human members of the chitinase protein family known so far are located on chromosome 1. According to the data deposited in Human Gene Map of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), the genes of YKL-39 and the human oviduct specific glycoprotein are located on 1p13 and that of HCgp-39, like the chitotriosidase gene, is on 1q31–1q32. The nature of the common deficiency in chitotriosidase activity was elucidated in this study. The defect was found to be a 24-bp duplication that activates a cryptic 3′ splice site in the same exon, causing the formation of mRNA with an in-frame internal deletion of 87 nucleotides. Similar mutations affecting splice site selection have been reported earlier for two lysosomal hydrolases, the β-subunit of β-hexosaminidase and arylsulfatase A, and for episialin (23Wakamatsu N. Kobayashi H. Miyatake T. Tsuji S. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2406-2413Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Hasegawa Y. Kawame H. Ida H. Ohashi T. Eto Y. Hum. Genet. 1994; 93: 415-420Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar, 25Lightenberg J.L. Gennissen A.M.C. Vos H.L. Hilkens J. Nucleic Acids Res. 1991; 19: 297-301Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). Based on the incidence of deficiency of chitotriosidase activity in The Netherlands and among Ashkenazim of about 6%, the Hardy-Weinberg equilibrium predicts that 37% of the population will be carriers of a mutant chitotriosidase gene. This prediction corresponds very well with the observed frequency of carriers of the 24-bp duplication in the chitotriosidase gene. This and the finding that all chitotriosidase-deficient individuals so far are homozygous for the duplication indicate that this mutation must be the predominant cause of chitotriosidase deficiency. The multi-ethnic occurrence and prevalence of the 24-bp duplication in the chitotriosidase gene suggests that it probably originated before the radiation of tribal populations that have formed the present ethnic groups. Cultured macrophages of chitotriosidase-deficient individuals contain very little mRNA and secrete almost no chitotriosidase protein. We have not been able to detect the mutant protein in plasma of chitotriosidase-deficient individuals, including Gaucher patients. Analysis of recombinant-produced mutant chitotriosidase indicated that the protein is enzymatically inactive. The mutant chitotriosidase is predicted to lack amino acids 344–372. For several homologous chitinases, the three-dimensional structure has been resolved by crystallographic analysis (26Terwisscha van Scheltinga A.C. Kalk K.H. Beintema J.J. Dijkstra B.W. Structure. 1994; 2: 1181-1189Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (222) Google Scholar, 27Perrakis A. Tews I. Dauter Z. Oppenheim A.B. Chet I. Wilson K.S. Vorgias C.E. Structure (Lond.). 1994; 2: 1169-1180Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (378) Google Scholar). The catalytic core structure of these hydrolases is thought to be an 8-stranded α/β (TIM) barrel (26Terwisscha van Scheltinga A.C. Kalk K.H. Beintema J.J. Dijkstra B.W. Structure. 1994; 2: 1181-1189Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (222) Google Scholar, 27Perrakis A. Tews I. Dauter Z. Oppenheim A.B. Chet I. Wilson K.S. Vorgias C.E. Structure (Lond.). 1994; 2: 1169-1180Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (378) Google Scholar, 28Coulson A.F. FEBS Lett. 1994; 354: 41-44Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar). On the basis of its homology with these chitinases, it can be predicted that the internal deletion in the mutant chitotriosidase will prevent the formation of a proper TIM-barrel conformation. In view of this, it is not surprising that the recombinant produced mutant protein shows no chitinolytic activity. On the basis of all our findings, it seems extremely unlikely that the mutant chitotriosidase allele renders a functional protein. Given the high incidence of chitotriosidase deficiency, it could be argued that the enzyme is redundant in man. However, it is unattractive to assume that the enzyme does no longer fulfill any function. The role of the homologous chitinases in plants in defense against fungal pathogens has been demonstrated convincingly (6Collinge D.B. Kragh K.M. Mikkelsen J.D. Nielsen K.K. Rasmussen U. Vad K. Plant J. 1993; 3: 31-40Crossref PubMed Scopus (775) Google Scholar, 7Flach J. Pilet P.E. Jolles P. Experientia (Basel). 1992; 48: 701-716Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar, 29Sahai A.S. Manocha M.S. FEMS Microbiol. Rev. 1993; 11: 317-338Crossref Scopus (317) Google Scholar, 30Broekaert W.F. van Parijs J. Allen A.K. Peumans W.J. Physiol. Mol. Pl. Pathol. 1988; 33: 319-331Crossref Scopus (126) Google Scholar, 31Roberts W.K. Selitrennikoff C.P. J. Gen. Microbiol. 1988; 134: 169-176Google Scholar, 32Benhamou N. Broglie K. Broglie R. Chet I. Can. J. Microbiol. 1993; 39: 318-328Crossref PubMed Scopus (102) Google Scholar, 33Schlumbaum A. Mauch F. Vögeli U. Boller T. Nature. 1986; 324: 365-367Crossref Scopus (786) Google Scholar, 34Huynh Q.K. Hironaka C.M. Levine E.B. Smith C.E. Borgmeyer J.R. Shah D.M. J. Biol. Chem. 1992; 267: 6635-6640Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The structural features of chitinases have been extremely well conserved in chitotriosidase. Furthermore, the expression of the enzyme in phagocytes is regulated in a remarkable manner. It seems therefore likely that chitotriosidase still fulfills a role, but that a deficiency can be somehow compensated. A comparison with the closely related lysozyme is of interest. The bactericidal function of this hydrolase is well established; nevertheless, in rabbits an inherited deficiency in lysozyme occurs that seems to have little consequence for susceptibility to infections (35Camara V.M. Harding J.W. Prieur D.J. Lab. Invest. 1990; 63: 544-550PubMed Google Scholar). The diverse array of defense mechanisms of the immune system in mammals probably renders sufficient tolerance to defects in single enzymes such as lysozyme and chitotriosidase. In this connection, it will be of interest to determine whether the chitotriosidase genotype of immunocompressed individuals is predictive for their risk on infections with fungal pathogens. It is intriguing to understand why the mutation in the chitotriosidase gene occurs with such high incidence in different ethnic groups. This could point to some selective advantage for carriers, but at present there are no clues for the nature of such a selective factor. In this connection, it will be essential to obtain detailed insight in the physiological role(s) of chitotriosidase and the mechanism(s) that can compensate for its absence. We thank Dr. C. de Vries for technical advises and Inge Pool, Fung Lin Au, and Wilma Donker for their skilful assistance. Drs. J. M. Tager, H. F. Tabak, P. Borst, R. Benne, and S. van Weely are acknowledged for comments and suggestions during the preparation of the manuscript. We thank Dr. M. Yazdanbakhsh for making samples available.

We have recently observed that chitotriosidase, a chitinolytic enzyme, is secreted by activated human macrophages and is markedly elevated in plasma of Gaucher disease patients (Hollak, C. E. M., van Weely, S., van Oers, M. H. J., and Aerts, J. M. F. G.(1994) J. Clin. Invest. 93, 1288-1292). Here, we report on the cloning of the corresponding cDNA. The nucleotide sequence of the cloned cDNA predicts a protein with amino acid sequences identical to those established for purified chitotriosidase. Secretion of active chitotriosidase was obtained after transient transfection of COS-1 cells with the cloned cDNA, confirming its identity as chitotriosidase cDNA. Chitotriosidase contains several regions with high homology to those present in chitinases from different species belonging to family 18 of glycosyl hydrolases. Northern blot analysis shows that expression of chitotriosidase mRNA occurs only at a late stage of differentiation of monocytes to activated macrophages in culture. Our results show that, in contrast to previous beliefs, human macrophages can synthesize a functional chitinase, a highly conserved enzyme with a strongly regulated expression. This enzyme may play a role in the degradation of chitin-containing pathogens and can be used as a marker for specific disease states. We have recently observed that chitotriosidase, a chitinolytic enzyme, is secreted by activated human macrophages and is markedly elevated in plasma of Gaucher disease patients (Hollak, C. E. M., van Weely, S., van Oers, M. H. J., and Aerts, J. M. F. G.(1994) J. Clin. Invest. 93, 1288-1292). Here, we report on the cloning of the corresponding cDNA. The nucleotide sequence of the cloned cDNA predicts a protein with amino acid sequences identical to those established for purified chitotriosidase. Secretion of active chitotriosidase was obtained after transient transfection of COS-1 cells with the cloned cDNA, confirming its identity as chitotriosidase cDNA. Chitotriosidase contains several regions with high homology to those present in chitinases from different species belonging to family 18 of glycosyl hydrolases. Northern blot analysis shows that expression of chitotriosidase mRNA occurs only at a late stage of differentiation of monocytes to activated macrophages in culture. Our results show that, in contrast to previous beliefs, human macrophages can synthesize a functional chitinase, a highly conserved enzyme with a strongly regulated expression. This enzyme may play a role in the degradation of chitin-containing pathogens and can be used as a marker for specific disease states.

In various mammals, enzymatically active and inactive members of family 18 glycosyl hydrolases, containing chitinases, have been identified. In man, chitotriosidase is the functional chitinolytic enzyme, whilst the homologous human cartilage 39‐kDa glycoprotein (HC gp‐39) does not exhibit chitinase activity and its function is unknown. This study establishes that HC gp‐39 is a chitin‐specific lectin. It is experimentally demonstrated that a single amino acid substitution in the catalytic centre of the 39‐kDa isoform of chitotriosidase, which generates a similar sequence to that in HC gp‐39, results in a loss of hydrolytic activity and creates the capacity to bind to chitin. The possible implication of the finding for chitinolytic and chitin‐binding proteins that are produced in high quantities by activated macrophages are discussed.

A growing body of evidence implicates ceramide and/or its glycosphingolipid metabolites in the pathogenesis of insulin resistance. We have developed a highly specific small molecule inhibitor of glucosylceramide synthase, an enzyme that catalyzes a necessary step in the conversion of ceramide to glycosphingolipids. In cultured 3T3-L1 adipocytes, the iminosugar derivative N-(5′-adamantane-1′-yl-methoxy)-pentyl-1-deoxynojirimycin (AMP-DNM) counteracted tumor necrosis factor-α–induced abnormalities in glycosphingolipid concentrations and concomitantly reversed abnormalities in insulin signal transduction. When administered to mice and rats, AMP-DNM significantly reduced glycosphingolipid but not ceramide concentrations in various tissues. Treatment of ob/ob mice with AMP-DNM normalized their elevated tissue glucosylceramide levels, markedly lowered circulating glucose levels, improved oral glucose tolerance, reduced A1C, and improved insulin sensitivity in muscle and liver. Similarly beneficial metabolic effects were seen in high fat–fed mice and ZDF rats. These findings provide further evidence that glycosphingolipid metabolites of ceramide may be involved in mediating the link between obesity and insulin resistance and that interference with glycosphingolipid biosynthesis might present a novel approach to the therapy of states of impaired insulin action such as type 2 diabetes.

Abstract Biallelic mutations in the glucocerebrosidase ( GBA1 ) gene cause Gaucher disease, characterized by lysosomal accumulation of glucosylceramide and glucosylsphingosine in macrophages. This and other lysosomal diseases occur with high frequency in Ashkenazi Jews. It has been proposed that the underlying mutations confer a selective advantage, in particular conferring protection against tuberculosis. Here, using a zebrafish Gaucher disease model, we find that the mutation GBA1 N370S, predominant among Ashkenazi Jews, increases resistance to tuberculosis through the microbicidal activity of glucosylsphingosine in macrophage lysosomes. Consistent with lysosomal accumulation occurring only in homozygotes, heterozygotes remain susceptible to tuberculosis. Thus, our findings reveal a mechanistic basis for protection against tuberculosis by GBA1 N370S and provide biological plausibility for its selection if the relatively mild deleterious effects in homozygotes were offset by significant protection against tuberculosis, a rampant killer of the young in Europe through the Middle Ages into the 19 th century. Significance Statement Gaucher disease is a recessively inherited disorder in which the lipids glucosylceramide and glucosylsphingosine accumulate in lysosomes of macrophages. Macrophages are the first immune cells to engulf infecting bacteria and we find that glucosylsphingosine increases their ability to kill Mycobacterium tuberculosis that causes tuberculosis. Gaucher disease due to a particular mutation is frequent in Ashkenazi Jews. Since from the middle ages they were often confined to areas of high tuberculosis prevalence, it has been proposed that the mutation prevailed because heterozygotes, who do not accumulate lipids nor manifest Gaucher disease, were protected. Our findings raise the possibility that selection operated on homozygotes manifesting mild forms of Gaucher disease who were protected against tuberculosis which would often have been fatal.