We established a multilayer microfluidic Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM)-on-a-chip to emulate developmental hematopoiesis from human pluripotent stem cells. We show that the AGM-chip efficiently derives endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) in the presence of mesenchymal stroma and endothelial cells. The AGM-chip could dissect the cellular and molecular mechanisms of human developmental hematopoiesis.