MB
Martin Brand
Author with expertise in Mitochondrial Dynamics and Reactive Oxygen Species Regulation
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
21
(90% Open Access)
Cited by:
10,879
h-index:
104
/
i10-index:
331
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

Topology of Superoxide Production from Different Sites in the Mitochondrial Electron Transport Chain

Julie St-Pierre et al.Nov 1, 2002
We measured production of reactive oxygen species by intact mitochondria from rat skeletal muscle, heart, and liver under various experimental conditions. By using different substrates and inhibitors, we determined the sites of production (which complexes in the electron transport chain produced superoxide). By measuring hydrogen peroxide production in the absence and presence of exogenous superoxide dismutase, we established the topology of superoxide production (on which side of the mitochondrial inner membrane superoxide was produced). Mitochondria did not release measurable amounts of superoxide or hydrogen peroxide when respiring on complex I or complex II substrates. Mitochondria from skeletal muscle or heart generated significant amounts of superoxide from complex I when respiring on palmitoyl carnitine. They produced superoxide at considerable rates in the presence of various inhibitors of the electron transport chain. Complex I (and perhaps the fatty acid oxidation electron transfer flavoprotein and its oxidoreductase) released superoxide on the matrix side of the inner membrane, whereas center o of complex III released superoxide on the cytoplasmic side. These results do not support the idea that mitochondria produce considerable amounts of reactive oxygen species under physiological conditions. Our upper estimate of the proportion of electron flow giving rise to hydrogen peroxide with palmitoyl carnitine as substrate (0.15%) is more than an order of magnitude lower than commonly cited values. We observed no difference in the rate of hydrogen peroxide production between rat and pigeon heart mitochondria respiring on complex I substrates. However, when complex I was fully reduced using rotenone, rat mitochondria released significantly more hydrogen peroxide than pigeon mitochondria. This difference was solely due to an elevated concentration of complex I in rat compared with pigeon heart mitochondria. We measured production of reactive oxygen species by intact mitochondria from rat skeletal muscle, heart, and liver under various experimental conditions. By using different substrates and inhibitors, we determined the sites of production (which complexes in the electron transport chain produced superoxide). By measuring hydrogen peroxide production in the absence and presence of exogenous superoxide dismutase, we established the topology of superoxide production (on which side of the mitochondrial inner membrane superoxide was produced). Mitochondria did not release measurable amounts of superoxide or hydrogen peroxide when respiring on complex I or complex II substrates. Mitochondria from skeletal muscle or heart generated significant amounts of superoxide from complex I when respiring on palmitoyl carnitine. They produced superoxide at considerable rates in the presence of various inhibitors of the electron transport chain. Complex I (and perhaps the fatty acid oxidation electron transfer flavoprotein and its oxidoreductase) released superoxide on the matrix side of the inner membrane, whereas center o of complex III released superoxide on the cytoplasmic side. These results do not support the idea that mitochondria produce considerable amounts of reactive oxygen species under physiological conditions. Our upper estimate of the proportion of electron flow giving rise to hydrogen peroxide with palmitoyl carnitine as substrate (0.15%) is more than an order of magnitude lower than commonly cited values. We observed no difference in the rate of hydrogen peroxide production between rat and pigeon heart mitochondria respiring on complex I substrates. However, when complex I was fully reduced using rotenone, rat mitochondria released significantly more hydrogen peroxide than pigeon mitochondria. This difference was solely due to an elevated concentration of complex I in rat compared with pigeon heart mitochondria. The free radical theory of aging states that it is the mitochondrial production of reactive oxygen species (ROS), 1The abbreviations used are: ROS, reactive oxygen species; MLSP, maximum lifespan; ETF, electron transfer flavoprotein; QOR, quinone oxidoreductase; UCPs, uncoupling proteins; SOD, superoxide dismutase; BSA, bovine serum albumin. such as superoxide and hydrogen peroxide, and the resulting accumulation of damage to macromolecules that causes aging and determines maximum lifespan (MLSP) (1Harman D. J. Gerontol. 1956; 2: 298-300Google Scholar, 2Harman D. J. Am. Geriatr. Soc. 1972; 20: 145-147Google Scholar). Comparative approaches have shed considerable light on the relationship between ROS and MLSP. Notably, the rate of superoxide production by submitochondrial particles (3Sohal R.S. Svensson I. Sohal B.H. Brunk U.T. Mech. Ageing Dev. 1989; 49: 129-135Google Scholar) and the rate of H2O2 production by mitochondria (4Sohal R.S. Svensson I. Brunk U.T. Mech. Ageing Dev. 1990; 53: 209-215Google Scholar) are inversely related to MLSP in different species. A complicating factor is the association of longer MLSP with lower metabolic rates within mammals or other groups, but this complication has been resolved by the observation that birds tend to have longer MLSP than mammals with the same metabolic rate. Thus pigeons (long MLSP) have a lower rate of mitochondrial H2O2 production than rats (shorter MLSP), even though these two species have similar standard metabolic rates (5Ku H.H. Sohal R.S. Mech. Ageing Dev. 1993; 72: 67-76Google Scholar, 6Barja G. Cadenas S. Rojas C. Perez-Campo R. Lopez-Torres M. Free Radic. Res. 1994; 21: 317-327Google Scholar, 7Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1997; 98: 95-111Google Scholar, 8Herrero A. Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 241-249Google Scholar). Similarly, canaries and parakeets (budgerigars) (long MLSP) have lower rates of mitochondrial H2O2 production than mice (shorter MLSP), although all three species have similar standard metabolic rates (9Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1998; 103: 133-146Google Scholar). Despite numerous studies reporting that mitochondria release H2O2, there is some controversy as to whether mitochondria are an important source of ROS under physiological and pathological conditions (10Forman H.J. Azzi A. FASEB J. 1997; 11: 374-375Google Scholar). In agreement with these concerns, Staniek and Nohl (12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar) reported that mitochondria respiring on complex I and complex II substrates do not generate H2O2 except in the presence of the complex III inhibitor antimycin A. They proposed that unspecific interactions between the commonly used methods of H2O2detection and mitochondria cause artificial rates of H2O2 production (11Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 1999; 1413: 70-80Google Scholar, 12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar). Two principal sites of superoxide generation have been identified in mitochondria: complex I and complex III. The relative importance of these two sites seems to vary with experimental conditions and between tissues and species (13Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1999; 31: 347-366Google Scholar). There is no clear consensus in the literature about which side of the mitochondrial inner membrane superoxide is generated by complex I and complex III. In the traditional view, complex III generates superoxide on the matrix side of the mitochondrial inner membrane (14Turrens J.F. Biosci. Rep. 1997; 17: 3-8Google Scholar). The semiquinone at centero of complex III of heart mitochondria was shown to be the main producer of superoxide based on inhibitor studies (15Turrens J.F. Alexandre A. Lehninger A.L. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 237: 408-414Google Scholar). However, the x-ray structure of complex III reveals that center o is oriented toward the intermembrane space (16Iwata S. Lee J.W. Okada K. Lee J.K. Iwata M. Rasmussen B. Link T.A. Ramaswamy S. Jap B.K. Science. 1998; 281: 64-71Google Scholar, 17Zhang Z. Huang L. Shulmeister V.M. Chi Y.I. Kim K.K. Hung L.W. Crofts A.R. Berry E.A. Kim S.H. Nature. 1998; 392: 677-684Google Scholar), suggesting that superoxide production by complex III is directed toward the cytoplasm and not toward the matrix. In support of this view, a recent study has reported that antimycin A-supplemented mitoplasts (mitochondria devoid of portions of outer membrane and cytochrome c) can release superoxide (18Han D. Williams E. Cadenas E. Biochem. J. 2001; 353: 411-416Google Scholar). In complex I, either the iron-sulfur centers (7Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1997; 98: 95-111Google Scholar, 19Genova M.L. Ventura B. Giuliano G. Bovina C. Formiggini G. Parenti Castelli G. Lenaz G. FEBS Lett. 2001; 505: 364-368Google Scholar) or the active site flavin (20Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Google Scholar) are thought to be mainly responsible for superoxide production. There is no x-ray crystal structure of complex I, but all of these centers are likely to face the matrix side of the membrane. 30 years ago, it was shown that the oxidation of palmitoyl carnitine by mitochondria leads to the generation of H2O2(21Boveris A. Oshino N. Chance B. Biochem. J. 1972; : 617-630Google Scholar, 22Boveris A. Chance B. Biochem. J. 1973; 134: 707-716Google Scholar). These results received little attention and, to our knowledge, no study has examined how lipid metabolism could cause ROS generation in mammalian mitochondria. The oxidation of fatty acids involves the electron transfer flavoprotein (ETF) and the electron transfer flavoprotein quinone oxidoreductase (ETF-QOR) that could act as potential sources of ROS production. The role of lipid metabolism in the generation of ROS by mitochondria gained our attention recently when it was shown that the expression of mitochondrial uncoupling proteins (UCPs) correlates with the use of lipid as fuel substrates (23Samec S. Seydoux J. Dulloo A.G. Faseb J. 1998; 12: 715-724Google Scholar, 24Cadenas S. Buckingham J.A. Samec S. Seydoux J. Din N. Dulloo A.G. Brand M.D. FEBS Lett. 1999; 462: 257-260Google Scholar) and that UCPs are activated by superoxide (25Echtay K.S. Roussel D. St-Pierre J. Jekabsons M.B. Cadenas S. Stuart J.A. Harper J.A. Roebuck S.J. Morrison A. Pickering S. Clapham J.C. Brand M.D. Nature. 2002; 415: 96-99Google Scholar). An interesting hypothesis is that the elevated expression of UCPs during increased reliance on lipid metabolism is a part of a mechanism to protect against high levels of ROS production during the oxidation of fatty acids. In light of the controversy regarding the production of H2O2 by mitochondria and its relevance to aging, additional studies to characterize the generation of ROS by mitochondria are required. The aims of the present study were 1) to quantify the production of ROS by intact mitochondria from different tissues, 2) to identify the electron transport sites involved in ROS generation, 3) to determine the topology of ROS production, on which side of the inner membrane ROS are produced, and 4) to re-examine differences in the production of ROS by heart mitochondria from rat and pigeon, species with similar standard metabolic rate but markedly different MLSP. The horseradish peroxidase, homovanillic acid, superoxide dismutase (SOD), and hydrogen peroxide solution, were purchased from Sigma. The substrates (malate, pyruvate, succinate, carnitine, and palmitoyl carnitine), inhibitors (rotenone, antimycin A, myxothiazol, and oligomycin), and bovine serum albumin (BSA) were also obtained from Sigma. Female Wistar rats aged between 5 and 8 weeks were used. Pigeons were provided by Abbott Brothers, Norfolk, UK. Skeletal muscle, heart, and liver mitochondria were isolated as described (26Rolfe D.F. Hulbert A.J. Brand M.D. Biochim. Biophys. Acta. 1994; 1188: 405-416Google Scholar), resuspended in standard assay medium containing 120 mm KCl, 5 mmKH2PO4, 3 mm Hepes, 1 mm EGTA, and 0.3% BSA (pH 7.2 at 20 °C) and kept on ice. Mitochondria were of good quality (at least 3-fold increase in respiration rate in the presence of an uncoupler). Protein content was determined using the Biuret method (27Gornall A.G. Bardawill C.J. David M.M.J. J. Biol. Chem. 1949; 177: 751-766Google Scholar) with BSA as standard. The rate of mitochondrial production of H2O2 was determined by following its reaction with homovanillic acid in the presence of horseradish peroxidase (28Barja G. Yu B.P. Methods in Aging Research. CRC Press, Boca Raton, FL1999: 533-548Google Scholar) using a Shimadzu RF5301 PC spectrofluorophotometer. Rat and pigeon mitochondria were incubated at 0.4 mg/ml at 37 °C and 41 °C, respectively, in standard assay medium. The following reactants were incorporated to the standard assay medium at the final concentrations indicated in parentheses. First, horseradish peroxidase (12 units/ml; one unit forms 18 μm per min of purpurogallin from pyrogallol at 25 °C) and homovanillic acid (0.1 mm) were added and a 3-min incubation period was allowed for temperature equilibration. Oligomycin (1 μg/mg mitochondrial protein), an inhibitor of the F1Fo-ATP synthase, was added to prevent ATP synthesis. Production of H2O2 was started by adding substrate: malate (1 mm) and pyruvate (2.5 mm) for complex I; succinate (5 mm), in the presence of rotenone (10 μm), for complex II or palmitoyl carnitine (60 μm), in the presence of l-carnitine (2 mm), as a lipid-derived substrate. Oxidation of palmitoyl carnitine generates equal amounts of NADH2, which enters the electron transport chain at complex I, and FADH2, which enters via the ETF and ETF-QOR. Calibration curves were obtained by adding known amounts of H2O2 to assay medium in the presence of the reactants (homovanillic acid and horseradish peroxidase). They were performed in the absence and presence of mitochondria to establish whether any mitochondrial components interfered with the assay. Standard curves were linear up to 6 μm H2O2 (Fig.1). Mitochondria quenched the fluorescence: the slopes of the standard curves obtained in the presence of liver, skeletal muscle, and heart mitochondria were 66, 81 and 86%, respectively, of the slope of the control curve without mitochondria (Fig. 1). Fig. 2 illustrates the effects of various corrections that we applied to the rates of H2O2 production using skeletal muscle as an example. Horseradish peroxidase and SOD were in excess in the experiments since doubling the final concentration of these enzymes did not affect the results (data not shown). Rates of mitochondrial H2O2 production were higher if calculated using the standard curve with mitochondria than using the control standard curve (Fig. 2; compare the black and white bars). There were significant rates of apparent H2O2production in the absence of mitochondria (calibrated using the control standard curve). SOD, added at 50 units/ml (one unit inhibits the rate of reduction of cytochrome c by 50% in a coupled system with xanthine and xanthine oxidase at pH 7.8 at 25 °C in a 3-ml reaction volume), caused significant interference to the detection method, increasing the fluorescence signal under all conditions (Fig.2, gray bars, and Fig. 3). The final rates of H2O2 production (fully corrected signals; dotted bars in Fig. 2) were obtained by subtracting the rates measured in the absence of mitochondria (calibrated without mitochondria: gray bars) from the rates measured in the presence of mitochondria (calibrated with mitochondria; white bars). All the following results represent fully corrected rates of H2O2 production.Figure 3Fluorometric traces of H2O2 production in the presence of malate and pyruvate (MP), oligomycin (O), and SOD. The figure shows typical traces obtained in the absence and presence of mitochondria illustrating the interference of SOD with the detection method.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) Various inhibitors of electron transport were used to define more precisely the sites of ROS production (28Barja G. Yu B.P. Methods in Aging Research. CRC Press, Boca Raton, FL1999: 533-548Google Scholar). Rotenone inhibits complex I, while myxothiazol (used at 0.625 nmol/mg protein) and antimycin A (used at 0.625 nmol/mg protein) inhibit centero and center i of complex III respectively. To determine which side of the mitochondrial inner membrane superoxide (O 2⨪) was generated, we measured the rate of H2O2 production in the presence and absence of exogenous SOD. If mitochondria produce O 2⨪ on the cytoplasmic face of the inner membrane, addition of exogenous SOD will increase the natural dismutation rate of O 2⨪ (and that catalyzed by any contaminating or endogenous SOD) and compete with other side reactions, leading to an elevated rate of H2O2 production. If mitochondria generate O 2⨪ on the matrix side of the inner membrane, much of it will be converted to H2O2by the matrix SOD. H2O2 will diffuse out, and there will be no difference in the rates of extramitochondrial H2O2 appearance in the presence and absence of exogenous SOD. Complex I concentration was measured as described by Burch (29Burch H. Methods Enzymol. 1957; 3: 960-963Google Scholar). Statistical analyses were performed using Sigma Stat 2.0. The H2O2 production rate of mitochondria from a given tissue with a given substrate was compared between different experimental conditions using one-way analysis of variance and the a posteriori Tukey test. Comparisons between rat and pigeon heart mitochondria were carried out using a paired t test. The level of significance wasp = 0.05. The rate of H2O2 production by skeletal muscle or heart mitochondria incubated with malate and pyruvate was very low and was not increased by addition of SOD (Figs.4 A and 5 A). However, the addition of rotenone to mitochondria respiring on malate and pyruvate induced a significant rate of H2O2generation (Figs. 4 A and5 A). This rotenone-stimulated H2O2 production came primarily from the matrix side of the inner membrane since the signal was insensitive to addition of exogenous SOD (Figs. 4 A and 5 A). These results indicate that complex I in skeletal muscle and heart mitochondria can generate superoxide on the matrix side of the inner membrane when it is fully reduced and inhibited by rotenone but that the rate measured when the complex is not inhibited by rotenone is extremely low.Figure 5Rates of H2O2production by rat heart mitochondria. Values are means ± S.E. A, malate plus pyruvate as substrates;n = 5–7. B, succinate (plus rotenone) as substrate; n = 5. C, palmitoyl carnitine (plus carnitine) as substrate; n = 4. Statistical significance (as in Fig. 4) is indicated by different letters.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) There was no detectable rate of H2O2 production when skeletal muscle or heart mitochondria were fed succinate (in the presence of rotenone) in the absence or presence of SOD (Figs.4 B and 5 B). There was little or no rate of H2O2 production in the presence of myxothiazol in the absence or presence of SOD (Figs. 4 B and5 B), showing that neither complex II nor the ubiquinone pool can produce significant amounts of O 2⨪ on either side of the membrane when they are extensively reduced. Addition of antimycin A led to a low but measurable rate of H2O2 production (Figs. 4 B and5 B) that was significantly increased by addition of exogenous SOD (Figs. 4 B and 5 B). These results indicate that center o of complex III can generate O 2⨪ on the cytoplasmic face of the inner membrane of skeletal muscle or heart mitochondria when it is reduced following inhibition of the complex at center i by antimycin A but that the rate measured when the complex is not inhibited by antimycin A is extremely low. There was some H2O2 production in the presence of antimycin A even without exogenous SOD, which might suggest that center o can also produce O 2⨪ on the matrix side of the inner membrane. However, even if mitochondria only produce O 2⨪ on the cytoplasmic face of the membrane, there will be a detectable rate of H2O2 production without exogenous SOD because of contaminating or endogenous SOD and the natural dismutation of O 2⨪ into H2O2. In other words, if a rate of H2O2 production has a SOD-sensitive and a SOD-insensitive part, we can state that the SOD-sensitive part emanates from the cytoplasmic face of the membrane but we cannot be certain whether the SOD-insensitive part represents the natural dismutation rate of O 2⨪ coming from the cytoplasmic face of the membrane or H2O2 coming from the matrix side of the membrane. Skeletal muscle or heart mitochondria respiring on palmitoyl carnitine had a significant rate of H2O2 production that was not significantly increased by addition of SOD (Figs. 4 Cand 5 C). This result indicates that oxidation of palmitoyl carnitine (unlike oxidation of malate and pyruvate or succinate plus rotenone) leads to significant ROS production and that this ROS is produced mostly on the matrix side of the inner membrane. The addition of rotenone led to a slight increase in the rate of H2O2 production that did not reach statistical significance and was SOD-insensitive (Figs. 4 C and5 C). The rates of H2O2 production in the presence of palmitoyl carnitine and rotenone were very similar to those in the presence of malate, pyruvate, and rotenone (Figs.4 A and 5 A), suggesting that complex I was the source of this ROS with either substrate when complex I was fully reduced in the presence of rotenone. In the absence of rotenone, perhaps complex I is more reduced with palmitoyl carnitine as substrate (due to reversed electron transport and competition with ETF-QOR for oxidized Q) than it is with malate and pyruvate, leading to greater endogenous ROS production from complex I with palmitoyl carnitine. In the presence of palmitoyl carnitine, the addition of myxothiazol led to an increase in the rate of H2O2 production that did not reach statistical significance in skeletal muscle mitochondria and was SOD-insensitive (Figs. 4 C and5 C). Under these conditions complex I, complex II, ETF-QOR, and the ubiquinone pool may all be strongly reduced. H2O2 production with palmitoyl carnitine plus myxothiazol was slightly (but not significantly) greater than with palmitoyl carnitine plus rotenone (Figs. 4 C and5 C); if this effect was real, it may be that ETF-QOR and ETF can also produce some O 2⨪ on the matrix side of the membrane. Complex II and the ubiquinone pool would not be the source of such O 2⨪ because there was no H2O2production in the presence of succinate and myxothiazol (Figs.4 B and 5 B). Addition of antimycin A to skeletal muscle or heart mitochondria supplemented with palmitoyl carnitine greatly increased the rate of H2O2 production (Figs. 4 C and5 C). This rate was increased by addition of SOD (in skeletal muscle mitochondria), showing that much of it was due to production of O 2⨪ on the cytoplasmic face of the inner membrane. Under these conditions complex I, complex II, ETF-QOR, the ubiquinone pool, and center o of complex III may all be strongly reduced. In the presence of SOD, H2O2 production with palmitoyl carnitine plus antimycin A appeared to be higher than the sum of the individual contributions from complex I, complex II, ETF-QOR, the ubiquinone pool, and center o of complex III. The reason for this discrepancy is unclear. In general, the rates of H2O2production of liver mitochondria were lower than those of skeletal muscle and heart mitochondria, particularly with succinate or with palmitoyl carnitine as substrate (compare Figs. 4, 5, and6), making reliable interpretations difficult. Liver mitochondria respiring on malate and pyruvate, produced less than 0.2 nmol H2O2/min/mg mitochondrial protein in the absence or presence of SOD (Fig.6 A). The addition of rotenone did not increase H2O2 production, but SOD appeared to increase the rate of H2O2 production in the presence of rotenone (Fig. 6 A). These results appear to suggest that complex I from liver mitochondria generates ROS on the cytoplasmic face of the inner membrane as well as on the matrix side, but because of the small signal we consider them to be unreliable. Liver mitochondria respiring on succinate did not generate H2O2 (Fig. 6 B), except perhaps for a small signal in the presence of SOD and antimycin A or myxothiazol. Liver mitochondria respiring on palmitoyl carnitine did not produce H2O2 (Fig. 6 C), except perhaps for a small signal in the presence of rotenone, antimycin A, or myxothiazol. However, the rates of H2O2 production were minimal, making it difficult to interpret their significance. In a separate series of experiments, neither rat nor pigeon heart mitochondria generated measurable amounts of H2O2 when supplemented with malate and pyruvate (Fig.7 A). The addition of rotenone increased the rate of H2O2 production in both species (Fig. 7 A). In the presence of rotenone, the H2O2 production rate per mg of mitochondrial protein was higher with rat mitochondria than pigeon mitochondria (Fig.7 A). The amount of complex I present in the two types of mitochondria was measured (Fig. 7 B) to see whether the greater capacity of rat heart mitochondria to produce ROS in the presence of rotenone was caused by a greater concentration of complex I. Complex I was significantly greater in rat mitochondria than in pigeon mitochondria. Fig. 7 C shows that the different capacities for ROS production between rat and pigeon heart mitochondria were lost when H2O2 production rate was expressed per mole of complex I. Mitochondria from rat skeletal muscle, heart, and liver respiring on substrates feeding exclusively to complex I (malate plus pyruvate) or complex II (rotenone plus succinate) in the absence of other inhibitors generated little or no measurable H2O2 (Figs. 4, 5, and 6). The absence of significant generation of H2O2 from mitochondria respiring on complex I and complex II substrates supports results from Staniek and Nohl (12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar) showing a lack of H2O2 production from rat heart mitochondria respiring on glutamate/malate, malate/pyruvate, and succinate. Hansfordet al. (36Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Google Scholar) and Liu et al. (20Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Google Scholar) also reported minimal rates of H2O2 production from rat heart, brain, or liver mitochondria with glutamate/malate or rotenone/succinate as substrates. In the absence of rotenone, succinate supports considerable ROS production from complex I by reverse electron transport (e.g. see Ref. 20Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Google Scholar); this aspect was not pursued in the present paper. However, many other studies have reported significant rates of H2O2 production in isolated mitochondria (reviewed in Ref. 13Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1999; 31: 347-366Google Scholar). Most of these studies used SOD in the assay (6Barja G. Cadenas S. Rojas C. Perez-Campo R. Lopez-Torres M. Free Radic. Res. 1994; 21: 317-327Google Scholar, 7Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1997; 98: 95-111Google Scholar, 8Herrero A. Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 241-249Google Scholar, 30Barja G. Herrero A. J. Bioenerg. Biomembr. 1998; 30: 235-243Google Scholar). We obtained considerable rates of H2O2 generation in the presence of SOD if we did not correct for background effects (Fig. 2). Therefore, some of the discrepancies in production of H2O2 by mitochondria respiring on complex I and II substrates between various studies might be due to the presence or absence of inhibitors of reversed electron transport or to methodological artifacts as suggested by Forman and Azzi (10Forman H.J. Azzi A. FASEB J. 1997; 11: 374-375Google Scholar) and Staniek and Nohl (12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar). In contrast, rat skeletal muscle and heart mitochondria produced H2O2 at measurable rates when respiring on palmitoyl carnitine with no added inhibitors (Figs. 4 and 5). This H2O2 was produced primarily on the matrix side of the membrane, since it was not significantly enhanced by addition of exogenous SOD. The greater H2O2 production with palmitoyl carnitine than with complex I substrates could be because complex I is more reduced with palmitoyl carnitine, due to reversed electron transport and competition with ETF-QOR for oxidized Q. Greater steady-state reduction of complex I would lead to greater matrix ROS production with palmitoyl carnitine as substrate. Additionally, it could be that ETF-QOR and ETF can also produce O 2⨪ on the matrix side of the membrane when palmitoyl carnitine is added. ETF accepts electrons from eight primary dehydrogenases in the mitochondrial matrix including those of the β-oxidation cycle. ETF is rapidly reduced to the semiquinone form (ETF 2⨪) and more slowly to the fully reduced form, suggesting that ETF 2⨪ is the electron donor to ETF-QOR (31Ramsay R.R. Steenkamp D.J. Husain M. Biochem. J. 1987; 241: 883-892Google Scholar). ETF-QOR can be fully reduced by accepting three electrons, but it accepts only two electrons when ETF is the electron donor (32Beckmann J.D. Frerman F.E. Biochemistry. 1985; 24: 3913-3921Google Scholar). It was proposed that the FAD prosthetic group of ETF-QOR cycles between the oxidized and semiquinone forms (31Ramsay R.R. Steenkamp D.J. Husain M. Biochem. J. 1987; 241: 883-892Google Scholar). These data suggest that ETF and ETF-QOR could act as generators of superoxide owing to their presence in partially reduced states during lipid metabolism. Early papers on the production of H2O2 by mitochondria showed that rat liver and pigeon heart mitochondria release H2O2 when respiring on 10 μm palmitoyl carnitine (21Boveris A. Oshino N. Chance B. Biochem. J. 1972; : 617-630Google Scholar, 22Boveris A. Chance B. Biochem. J. 1973; 134: 707-716Google Scholar). These results gained little attention since succinate gave higher rates of H2O2 production. However, the lower rates of H2O2 production with palmitoyl carnitine in these early reports might reflect the absence of catalytic carnitine and the use of subsaturating concentrations of palmitoyl carnitine. It is tempting to speculate that increased production of ROS by mitochondria during lipid metabolism might lead to an increase in the expression and activity of UCPs to counteract the deleterious effects of ROS on mitochondria. In fact, UCP2 and UCP3 expression is increased when fatty acids are high (23Samec S. Seydoux J. Dulloo A.G. Faseb J. 1998; 12: 715-724Google Scholar, 24Cadenas S. Buckingham J.A. Samec S. Seydoux J. Din N. Dulloo A.G. Brand M.D. FEBS Lett. 1999; 462: 257-260Google Scholar). Fatty acids and superoxide activate uncoupling by UCPs, and it was recently suggested that the primary role of UCP2 and UCP3 might be for protection against ROS (25Echtay K.S. Roussel D. St-Pierre J. Jekabsons M.B. Cadenas S. Stuart J.A. Harper J.A. Roebuck S.J. Morrison A. Pickering S. Clapham J.C. Brand M.D. Nature. 2002; 415: 96-99Google Scholar). It is commonly repeated that 2% of electron flow during mitochondrial respiration gives rise to H2O2 (33Chance B. Sies H. Boveris A. Physiol. Rev. 1979; 59: 527-605Google Scholar). More recently, Hansford et al. (36Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Google Scholar) reported values of free radical leak in the range of 0.4–0.8% for heart mitochondria respiring on physiological concentrations of succinate (less than 0.5 mm). Even if we consider our results with saturating palmitoyl carnitine (0.15 nmol of H2O2/min/mg of mitochondrial protein) for skeletal muscle mitochondria (Fig. 4), only 0.15% of electron flow gives rise to H2O2under resting conditions with a respiration rate of 200 nmol of electrons/min/mg of mitochondrial protein. This estimate of free radical leak would be lower at physiological partial pressure of oxygen, since the rate of H2O2 production by mitochondria decreases steadily with oxygen tension (22Boveris A. Chance B. Biochem. J. 1973; 134: 707-716Google Scholar). It would be even lower in more physiologically realistic conditions of subsaturating palmitoyl carnitine and lower mitochondrial membrane potential due to background ATP synthesis. Therefore, our upper estimate of free radical leak is one to two orders of magnitude lower than the frequently cited values. The results presented in this paper show that rat heart and skeletal muscle mitochondria generally display considerably higher rates of H2O2 production than liver mitochondria either in the absence or presence of inhibitors, consistent with the idea that postmitotic tissues generate more ROS through accumulation of oxidative damage (34Papa S. Skulachev V.P. Mol. Cell Biochem. 1997; 174: 305-319Google Scholar). A simpler explanation for these results is that liver mitochondria have a reduced content of mitochondrial electron transport chain components compared with heart and skeletal muscle (35Kwong L.K. Sohal R.S. Arch. Biochem. Biophys. 2000; 373: 16-22Google Scholar). Specifically, rat liver mitochondria have approximately 10 times less complex I and six times less complex III activity than heart or skeletal muscle mitochondria (35Kwong L.K. Sohal R.S. Arch. Biochem. Biophys. 2000; 373: 16-22Google Scholar). To identify the major potential sites of mitochondrial ROS production and the topology of ROS production from them, we used inhibitors of complex I and III of the electron transport chain. The inhibitors should strongly reduce different respiratory complexes and cause them to generate sufficient ROS to override the natural antioxidant systems of mitochondria. This allowed us to determine which complex has the largest capacity to generate ROS. The presence and absence of SOD permitted the identification of the topology of ROS production. We found that center o of complex III (rotenone plus succinate plus antimycin A) can generate more ROS than complex I (malate plus pyruvate plus rotenone) (Figs. 4 and 5). Center o of complex III generates superoxide (at least in part, and probably exclusively) on the cytoplasmic face of the mitochondrial inner membrane, whereas complex I produces ROS solely on the matrix side. Experiments using mitoplasts indicated that complex III can release superoxide on the cytoplasmic face of the inner membrane (18Han D. Williams E. Cadenas E. Biochem. J. 2001; 353: 411-416Google Scholar). Many studies using intact mitochondria have reported increases in H2O2production in the presence of antimycin A and rotenone (12Staniek K. Nohl H. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1460: 268-275Google Scholar, 13Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1999; 31: 347-366Google Scholar, 22Boveris A. Chance B. Biochem. J. 1973; 134: 707-716Google Scholar, 36Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Google Scholar,37Kwong L.K. Sohal R.S. Arch. Biochem. Biophys. 1998; 350: 118-126Google Scholar). However, none of these studies examined the topology of ROS production. Mitochondria respiring on complex I substrates increase their H2O2 production in the presence of myxothiazol (13Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1999; 31: 347-366Google Scholar, 36Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Google Scholar). Since the rates in the presence of rotenone in these studies are similar or higher than those in the presence of myxothiazol, it is probable that the ROS generated in the presence of myxothiazol actually originated from complex I. Finally, the possible SOD-insensitive increase in the rate of H2O2production by mitochondria supplemented with palmitoyl carnitine and myxothiazol leads us to suggest that ETF and ETF-QOR may also produce ROS on the matrix side of the inner membrane (Figs. 4 and 5). At a physiological level, our results showing very low H2O2 production by mitochondria respiring on complex I and II substrates in the absence of inhibitors fail to provide support for the conclusions that there is an inverse relationship between MLSP and H2O2 production by mitochondria from various species (4Sohal R.S. Svensson I. Brunk U.T. Mech. Ageing Dev. 1990; 53: 209-215Google Scholar) or that pigeon mitochondria respiring on complex I or II substrates generate less H2O2 than rat mitochondria (5Ku H.H. Sohal R.S. Mech. Ageing Dev. 1993; 72: 67-76Google Scholar, 6Barja G. Cadenas S. Rojas C. Perez-Campo R. Lopez-Torres M. Free Radic. Res. 1994; 21: 317-327Google Scholar, 7Herrero A. Barja G. Mech. Ageing Dev. 1997; 98: 95-111Google Scholar, 8Herrero A. Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 241-249Google Scholar, 30Barja G. Herrero A. J. Bioenerg. Biomembr. 1998; 30: 235-243Google Scholar). Indeed, we found that heart mitochondria from pigeons and rats respiring on malate/pyruvate did not generate measurable amounts of H2O2. In the presence of rotenone, however, rat mitochondria produced more H2O2 per mg of mitochondrial protein than did pigeon mitochondria (Fig.7 A), showing that the capacity of rat mitochondria to generate ROS is indeed higher. This was caused by a higher content of complex I in rat heart mitochondria (Fig. 7 B). The rates of ROS production per mole of complex I were not higher in rat mitochondria, suggesting that complex I from pigeon heart mitochondria does not have a decreased intrinsic capacity for ROS production. These data confirm that the maximum capacity of pigeon heart mitochondria to generate ROS from complex I is less than in rat, but fail to provide support for the theory that the elevated MLSP of pigeons compared with rats is partially due to their lower endogenous mitochondrial production of H2O2. It would be enlightening to compare mitochondrial H2O2 production between animals of different MLSP using palmitoyl carnitine. Finally, our results should not be interpreted as meaning that mitochondria produce no ROS under physiological conditions, where the major substrates will usually be pyruvate from glycolysis or long chain fatty acyl carnitines from lipid oxidation. Our results suggest that if complexes I and III of mitochondria do produce ROS physiologically during oxidation of pyruvate through the Krebs cycle, these ROS are mostly scavenged by antioxidant defense systems and little or no H2O2 escapes into the cytosol. On the other hand, fatty acid β-oxidation does lead to release of ROS, primarily from complex I on the matrix side of the inner membrane, which can lead to H2O2 spilling out into the cytosol. However, it is important to emphasize that whatever the substrate, complex I, complex III, and perhaps ETF and ETF-QOR do have the capacity to generate superoxide. A consistent small leak of electrons to oxygen that escapes the antioxidant defense systems during normal metabolism might still be sufficient to cause accumulation of oxidative damage, ultimately resulting in aging. We thank Federica Draghi and Judy Hirst for measurements of complex I concentrations and Linda Partridge for critical comments.
0

A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells

Frank Buttgereit et al.Nov 15, 1995
The rates of different ATP-consuming reactions were measured in concanavalin A-stimulated thymocytes, a model system in which more than 80% of the ATP consumption can be accounted for. There was a clear hierarchy of the responses of different energy-consuming reactions to changes in energy supply: pathways of macromolecule biosynthesis (protein synthesis and RNA/DNA synthesis) were most sensitive to energy supply, followed by sodium cycling and then calcium cycling across the plasma membrane. Mitochondrial proton leak was the least sensitive to energy supply. Control analysis was used to quantify the relative control over ATP production exerted by the individual groups of ATP-consuming reactions. Control was widely shared; no block of reactions had more than one-third of the control. A fuller control analysis showed that there appeared to be a hierarchy of control over the flux through ATP: protein synthesis &gt; RNA/DNA synthesis and substrate oxidation &gt; Na+ cycling and Ca2+ cycling &gt; other ATP consumers and mitochondrial proton leak. Control analysis also indicated that there was significant control over the rates of individual ATP consumers by energy supply. Each ATP consumer had strong control over its own rate but very little control over the rates of the other ATP consumers.
0

Mitofusin-2 Determines Mitochondrial Network Architecture and Mitochondrial Metabolism

Daniel Bach et al.May 1, 2003
In many cells and specially in muscle, mitochondria form elongated filaments or a branched reticulum. We show that Mfn2 (mitofusin 2), a mitochondrial membrane protein that participates in mitochondrial fusion in mammalian cells, is induced during myogenesis and contributes to the maintenance and operation of the mitochondrial network. Repression of Mfn2 caused morphological and functional fragmentation of the mitochondrial network into independent clusters. Concomitantly, repression of Mfn2 reduced glucose oxidation, mitochondrial membrane potential, cell respiration, and mitochondrial proton leak. We also show that the Mfn2-dependent mechanism of mitochondrial control is disturbed in obesity by reduced Mfn2 expression. In all, our data indicate that Mfn2 expression is crucial in mitochondrial metabolism through the maintenance of the mitochondrial network architecture, and reduced Mfn2 expression may explain some of the metabolic alterations associated with obesity. In many cells and specially in muscle, mitochondria form elongated filaments or a branched reticulum. We show that Mfn2 (mitofusin 2), a mitochondrial membrane protein that participates in mitochondrial fusion in mammalian cells, is induced during myogenesis and contributes to the maintenance and operation of the mitochondrial network. Repression of Mfn2 caused morphological and functional fragmentation of the mitochondrial network into independent clusters. Concomitantly, repression of Mfn2 reduced glucose oxidation, mitochondrial membrane potential, cell respiration, and mitochondrial proton leak. We also show that the Mfn2-dependent mechanism of mitochondrial control is disturbed in obesity by reduced Mfn2 expression. In all, our data indicate that Mfn2 expression is crucial in mitochondrial metabolism through the maintenance of the mitochondrial network architecture, and reduced Mfn2 expression may explain some of the metabolic alterations associated with obesity. phosphate-buffered saline Dulbecco's modified Eagle's medium fetal bovine serum green fluorescent protein antisense sequence In many cell types, especially muscle fibers, mitochondria form tubular structures or networks (1Bakeeva L.E. Chentsov Yu.S. Skulachev V.P. Biochim. Biophys. Acta. 1978; 501: 349-369Crossref PubMed Scopus (173) Google Scholar, 2Kirkwood S.P. Munn E.A. Brooks G.A. Am. J. Physiol. 1986; 251: C395-C402Crossref PubMed Google Scholar). In fibroblasts and cardiomyocytes, mitochondrial filaments conduct mitochondrial membrane potential (3Amchenkova A.A. Bakeeva L.E. Chentsov Y.S. Skulachev V.P. Zorov D.B. J. Cell Biol. 1988; 107: 481-495Crossref PubMed Scopus (220) Google Scholar, 4Skulachev V.P. Trends Biochem. Sci. 2001; 26: 23-29Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (359) Google Scholar). The electrical activity of the mitochondrial network in large cells such as muscle fibers may permit the movement of energy from the cell periphery to the cell core. There is evidence in Saccharomyces, Aspergillus, and mammalian cells that mitochondrial filaments are highly dynamic structures (5Nunnari J. Marshall W.F. Straight A. Murray A. Sedat J.W. Walter P. Mol. Biol. Cell. 1997; 8: 1233-1242Crossref PubMed Scopus (393) Google Scholar, 6Suelmann R. Fischer R. Cell Motil. Cytoskelet. 2000; 45: 42-50Crossref PubMed Scopus (78) Google Scholar, 7Collins T.J. Berridge M.J. Lipp P. Bootman M.D. EMBO J. 2002; 21: 1616-1627Crossref PubMed Scopus (455) Google Scholar). In yeast this dynamic is regulated by changes in the rates of mitochondrial fission and fusion. Based on the isolation and analysis of yeast mutants that are defective in mitochondrial division and fusion, several laboratories have isolated proteins that mediate mitochondrial fission and fusion (8Jensen R.E. Aiken Hobbs A.E. Cerveny K.L. Sesaki H. Micros. Res. Tec. 2000; 51: 573-583Crossref PubMed Scopus (118) Google Scholar, 9Shaw J.M. Nunnari J. Trends Cell Biol. 2002; 12: 178-184Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (302) Google Scholar). Mitochondrial fusion in yeast and Drosophila depends on the integrity of thefzo gene that encodes a mitochondrial transmembrane GTPase (10Hales K.G. Fuller M.T. Cell. 1997; 90: 121-129Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (464) Google Scholar, 11Rapaport D. Brunner M. Neupert W. Westermann B. J. Biol. Chem. 1998; 273: 20150-20155Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (289) Google Scholar). Thus, loss of function of fzo causes fragmentation of mitochondrial tubules in yeast (11Rapaport D. Brunner M. Neupert W. Westermann B. J. Biol. Chem. 1998; 273: 20150-20155Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (289) Google Scholar) and alteration of spermatogenesis and male sterility in Drosophila (10Hales K.G. Fuller M.T. Cell. 1997; 90: 121-129Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (464) Google Scholar). Yeast Dnm1p and Mgm1p proteins (12Otsuga D. Keegan B.R. Brisch E. Thatcher J.W. Hermann G.J. Bleazard W. Shaw J.M. J. Cell Biol. 1998; 143: 333-349Crossref PubMed Scopus (330) Google Scholar, 13Guan K. Farh L. Marshall T.K. Deschenes R.J. Curr. Genet. 1993; 24: 141-148Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar, 14Shepard K Yaffe M. J. Cell Biol. 1999; 144: 711-719Crossref PubMed Scopus (146) Google Scholar) are structurally related to the dynamin GTPase and also contribute to mitochondrial fission (15Wong E.D. Wagner J.A. Gorsich S.W. McCaffery J.M. Shaw J.M. Nunnari J. J. Cell Biol. 2000; 151: 341-352Crossref PubMed Scopus (262) Google Scholar, 16Mozdy A.D. McCaffery J.M. Shaw J.M. J. Cell Biol. 2000; 151: 367-379Crossref PubMed Scopus (523) Google Scholar). Dnm1p operates in conjunction with Mdv1/Fis2/Gag3 and Mdv2/Fis1 to regulate mitochondrial fission (16Mozdy A.D. McCaffery J.M. Shaw J.M. J. Cell Biol. 2000; 151: 367-379Crossref PubMed Scopus (523) Google Scholar, 17Tieu Q. Nunnart J. J. Cell Biol. 2000; 151: 353-365Crossref PubMed Scopus (278) Google Scholar, 18Fekkes P. Shepard K.A. Yaffe M.P. J. Cell Biol. 2000; 151: 333-340Crossref PubMed Scopus (135) Google Scholar). Because mammals have genes that are homologous to fzo, Dnm, and Mgm1p (19Smirnova E. Shurland D.L. Ryazantsev S.N. van der Bliek A.M. J. Cell Biol. 1998; 143: 351-358Crossref PubMed Scopus (565) Google Scholar, 20Delettre C. Lenaers G. Griffoin J.M. Gigarel N. Lorenzo C. Belenguer P. Pelloquin L. Grosgeorge J. Turc-Carel C. Perret E. Astarie- Dequeker C. Lasquellec L. Arnaud B. Ducommun B. Kaplan J. Hamel C.P. Nat. Genet. 2000; 26: 207-210Crossref PubMed Scopus (1130) Google Scholar, 21Alexander C. Votruba M. Pesch U.E. Thiselton D.L. Mayer S. Moore A. Rodriguez M. Kellner U. Leo-Kottler B. Auburger G. Bhattacharya S.S. Wissinger B. Nat. Genet. 2000; 26: 211-215Crossref PubMed Scopus (1037) Google Scholar, 22Santel A. Fuller M.T. J. Cell Sci. 2001; 114: 867-874Crossref PubMed Google Scholar), such fusion and fission events may also be critical for the architecture of mitochondrial networks in mammalian cells. Tissues with high and variable rates of aerobic metabolism such as skeletal muscle or heart show a more prominent development of the mitochondrial network (1Bakeeva L.E. Chentsov Yu.S. Skulachev V.P. Biochim. Biophys. Acta. 1978; 501: 349-369Crossref PubMed Scopus (173) Google Scholar, 2Kirkwood S.P. Munn E.A. Brooks G.A. Am. J. Physiol. 1986; 251: C395-C402Crossref PubMed Google Scholar), although this remains unexplained. In addition, the extent of the mitochondrial network is regulated by hypoxic conditions (23Bereiter-Hahn J. Int. Rev. Cytol. 1990; 122: 1-63Crossref PubMed Scopus (275) Google Scholar). These data suggest that the mitochondrial network per se or proteins that participate in the generation of the mitochondrial network may be involved in the control of mitochondrial energy metabolism. In this study, we screened differentially expressed genes in skeletal muscle from obese Zucker rats, and we isolated the fzohomologue mitofusin 2 (Mfn2). We demonstrate that Mfn2 expression is crucial to the maintenance of the morphology and operation of the mitochondrial network and in mitochondrial metabolism. We also show that this regulatory mechanism is disturbed in obesity. Messenger RNA was extracted fromgastrocnemius muscle of control (fa/+) and obese (fa/fa) rats with oligo(dT)20-cellulose columns, as described (24Mora S. Monden I. Zorzano A. Keller K. Biochem. J. 1997; 324: 455-459Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar). Complementary DNA was prepared from 2 ॖg of mRNA using Superscript II (Invitrogen). A PCR-Select cDNA Subtraction kit (Clontech) was used to select for genes that are down-regulated in the obese. The cDNA fragments obtained were arrayed on 96-well plates and screened using labeled cDNA from lean or control rats. Northern blot assays from 20 ॖg of total RNA were performed as described (25Castello A. Rodriguez-Manzaneque J.C. Camps M. Perez-Castillo A. Testar X. Palacin M. Santos A. Zorzano A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 5905-5912Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) using as probes the32P-labeled C31 cDNA fragment (321 bp) obtained from the subtractive hybridization or the 32P-labeled stem-cell factor cDNA fragment obtained by PCR. The C31 cDNA fragment is identical to the nucleotide sequence 2098–2419 of the rat U41803(GenBankTM). Retrotranscription and competitive-quantitative PCR was performed from 0.1 ॖg of total RNA from vastus lateralis muscle from lean and obese subjects, as described (26Auboeuf D. Vidal H. Anal. Biochem. 1997; 245: 141-148Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar). Briefly, for each sample Mfn2 mRNA and an internal competitor at different known concentrations were co-amplified with the same pair of primers: 5′-atgcatccccacttaagcac-3′ and 5′-ccagagggcagaactttgtc-3′. Mfn2 concentration was extrapolated from the point at which both products are amplified to the same extent. Thirteen healthy lean volunteers (51 ± 2 years; body mass index, 23 ± 1 kg/m2; blood glucose, 4.9 + 0.1 mmol/liter; plasma insulin, 34 ± 2 pmol/liter) and nine obese volunteers (46 ± 2 years; body mass index, 34 ± 1 kg/m2; blood glucose, 4.9 + 0.1 mmol/liter; plasma insulin, 62 ± 6 pmol/liter) participated in the study. Percutaneous biopsies of the vastus lateralismuscle were obtained before a 3-h euglycemic hyperinsulinemic clamp (insulin infusion rate of 12 pmol/kg/min), as described elsewhere (27Andreelli F. Laville M. Ducluzeau P.H. Vega N. Vallier P. Khalfallah Y. Riou J.P. Vidal H. Diabetologia. 1999; 42: 358-364Crossref PubMed Scopus (58) Google Scholar). Insulin-stimulated glucose utilization was determined as reported (26Auboeuf D. Vidal H. Anal. Biochem. 1997; 245: 141-148Crossref PubMed Scopus (120) Google Scholar). A rabbit antibody against the Mfn2 specific peptide LGPKNSRRALMGYNDQVQRP was purchased from Research Genetics. Anti-Porin antiserum was used as a mitochondrial marker. Proteins from total homogenates or fractions enriched in mitochondria were resolved in 107 SDS-PAGE and transferred to Immobilon sheets. Incubation with antibodies and ECL detection were performed as described (25Castello A. Rodriguez-Manzaneque J.C. Camps M. Perez-Castillo A. Testar X. Palacin M. Santos A. Zorzano A. J. Biol. Chem. 1994; 269: 5905-5912Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Cells grown on coverslips were fixed for 20 min with 37 paraformaldehyde in PBS,1then washed three times in PBS, and incubated for 10 min in PBS containing 50 mm NH4Cl, 10 min in PBS containing 20 mm glycine, and 30 min in PBS containing 107 normal goat serum. Subsequently coverslips were incubated with primary antibodies at 0.5–1.0 ॖg/ml (anti-COXI subunit, Molecular Probes, Leiden, The Netherlands; anti-Myc 9E10, ATCC, Manassas, VA) diluted in PBS containing 107 goat serum for 1 h at room temperature. After washing in PBS, the coverslips were incubated with fluorochrom-conjugated (Oregon Green or Texas Red) goat secondary antibodies for 45 min. The cells were washed three times in PBS prior to mounting in immunofluore medium (ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH). MitoTracker Red CXRos and JC-1 (Molecular Probes, The Netherlands) were used to label mitochondria using the manufacturer's protocol. Briefly, the cells were incubated with 0.5 ॖg/ml mitochondrial dye diluted in DMEM incomplete medium at 37 °C for 30 min. Thereafter the cells were washed in PBS warmed to 37 °C and fixed with 37 paraformaldehyde in PBS or were processed in vivo. To assess mitochondrial connectivity, the laser microirradiation technique was applied to cause mitochondrial membrane perforation in living cells previously stained with JC-1. A continuous argon laser (at λ = 488 nm) with an output of 11.4 mW was used. The duration of the light laser irradiation was 60 s, and the diameter of the focused laser spot was 0.5 ॖm. The cells were viewed by confocal microscopy before and 1.5 and 5 min after laser irradiation. The confocal images were obtained using a Leica TCS 4D laser confocal fluorescence microscope with a 63× objective at the Serveis Cientı́fico-Tècnics, University of Barcelona. JC-1 is a cationic fluorescent dye (green color as monomer; 539 nm) that accumulates in mitochondria in a potential-dependent manner. Its accumulation in mitochondria leads to high concentrations of the dye and the subsequent formation of red fluorescent aggregates (597 nm). The concentration of JC-1 green monomers in the mitochondria increases proportionally to the membrane potential, and they form J-aggregates when green monomers concentration reach a certain level. This critical concentration is reached when membrane potential exceeds −240 mV. This allows the membrane potential measurement by determination of red, relative to green, emitted light irrespective of the number of mitochondria measured per image (28Di Lisa F. Blank P.S. Colonna R. Gambassi G. Silverman H.S. Stern M.D. Hansford R.G. J. Physiol. (Lond.). 1995; 486: 1-13Crossref Scopus (235) Google Scholar, 29Damdimopoulos A.E. Miranda-Vizuete A. Pelto-Huikko M. Gustafsson J.A. Spyrou G. J. Biol. Chem. 2002; 277: 33249-33257Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (165) Google Scholar). To measure differences in mitochondrial membrane potential between control cells and Mfn-2 knock-out cells, the dual emission of the potentiometric dye JC-1 was observed, and the red/green fluorescence ratio was measured. The cells were incubated with 1 ॖm JC-1 (Molecular Probes) diluted in DMEM with 27 FBS for 20 min at 37 °C. The cells were washed once in DMEM with 27 FBS and viewed in vivo at the confocal microscope. Z-series stacks (always at the same nonsaturating conditions) were taken to measure red (597 nm) and green (539 nm) fluorescence. JC-1 potentiometric method accuracy was validated using carbonyl cyanidep-trifluoromethoxyphenylhydrazone (10 ॖm) and oligomycin (0.5 ॖg/ml) to assess minimal and maximal mitochondrial membrane potential either by confocal microscopy or by flow cytometry (data not shown). The volume and surface area of skeletal muscle mitochondria were measured by the “vertical sections” method (30Baddeley A.J. Gundersen H.J.G. Cruz-Orive L.M. J. Microsc. (Oxf.). 1986; 142: 259-276Crossref PubMed Scopus (933) Google Scholar). Soleus muscles from four obese Zucker rats and four control lean rats were fixed and sectioned in random orientations, always perpendicular to their longitudinal axis, and 80 photographs/group at 5,000× were taken at random. The photographs were taken excluding the subsarcolemmal mitochondria population and always including Z-disc in the field. For each image, the mitochondrial surface area and volume were calculated from the number of randomly distributed points and cycloid arcs in a grid. The number of points inside the mitochondria is taken as the volume, and the number of cycloid arcs crossing the mitochondrial outer membrane is taken as the area. The volume/area ratio is an intrinsic parameter of mitochondria and does not depend on number of mitochondria studied. 10T/2 fibroblasts were grown in DMEM containing 107 FBS. A plasmid enclosing two independent expression cassettes expressing Mfn2 and GFP was prepared for transient transfection. Each expression cassette was driven by a cytomegalovirus promoter and contained an SV40 polyadenylation signal. Transfected cells were identified by GFP fluorescence. Cells transfected with the empty vector were used as control. For electron microscopy, the transfected cells were sorted using flow cytometry; thereafter, GFP-expressing cells were pelleted and processed for Spurr embedding and ultramicrotomy. For stable transfection, IMAGE clone 3746-e24 was digested withKpnI and XhoI, and the antisense fragment corresponding to sequence 1–370 from mouse Mfn2 (GenBankTMaccession number AY028170) was purified and cloned into pcDNA3 vector (Invitrogen) between the XhoI and KpnI sites. Geneticin selection at 500 ॖg/ml allowed isolation of individual clones. All of the transfections were performed with 20 ॖg of plasmid by the calcium phosphate method (31Santalucia T. Boheler K.R. Brand N.J. Sahye U. Fandos C. Vinals F. Ferre J. Testar X. Palacin M. Zorzano A. J. Biol. Chem. 1999; 274: 17626-17634Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (44) Google Scholar). Recombinant adenovirus expressing GFP, lacZ, or antisense Mfn2 cDNA fragment were generated by homologous recombination as previously described (32Bett A.J. Haddara W. Prevec L. Graham F.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 8802Crossref PubMed Scopus (682) Google Scholar). The mouse Mfn2 sequence between nucleotides 1 and 370 was cloned in antisense orientation in the shuttle plasmid pdelE1sp1A and co-transfected with pJM17 into 293 cells to achieve homologous recombination. Individual plaques were isolated and checked for mRNA expression after infection of 293 cells. Recombinant adenovirus were further amplified in 293 cells, purified by cesium chloride gradient centrifugation, dialyzed against 1 mm MgCl2, 10 mmTris, pH 7.4, 107 glycerol and stored at −80 °C. DNA was isolated from purified viral particles, and the recombinant viral genome was verified by restriction enzyme analysis. Viral stocks were titrated by infecting 293 cells with serial dilutions of the preparation and counting plaque forming units on the monolayer 15 days after infection. Glucose oxidation was measured in cells expressing or not a Mfn2 antisense sequence. The cells were incubated in Hanks' balanced salt medium (27 FBS, 5 mmol/liter glucose) containing 0.33 ॖm[14C](U)-d-glucose (323 Ci/mol) (Amersham Biosciences), and 14CO2 was trapped and measured as described (33Auestad N. Korsak R.A. Morrow J.W. Edmond J. J. Neurochem. 1991; 56: 1376-1386Crossref PubMed Scopus (193) Google Scholar). The respiration rates were measured using two 2-ml Clark oxygen electrodes (Rank Brothers, Bottisham, Cambridge, UK) at 37 °C and connected to a Kipp & Zonendual channel chart recorder, assuming 479 nmol O/ml at air saturation. The cell respiration rates were expressed as a function of cell number. The cells were diluted with Krebs-Ringer buffer supplemented with 5 mm glucose and bovine serum albumin 27 to 4.106 cells/ml in a 2-ml Clark electrode at 37 °C. Inhibitors were used at times and concentrations that caused maximal inhibition (data not shown), and the measurements were performed at 707 air saturation after at least 5 min. Respiration insensitive to myxothiazol (200 ॖm) was defined as nonmitochondrial, and respiration sensitive to myxothiazol was defined as mitochondrial. Similarly, respiration sensitive to oligomycin (80 ॖg/ml) was defined as coupled respiration, and respiration insensitive to oligomycin but sensitive to myxothiazol was defined as respiration driving proton leak or uncoupled respiration. In a screening designed to identify genes differentially expressed in obese Zucker rats using PCR-select cDNA subtraction, we isolated a 321-bp clone (C31) that hybridized with a 4.7-kb mRNA species in skeletal muscle. C31 cDNA sequence was identical to the sequence in GenBankTM between nucleotides 2098 and 2419 of rat U41803 and 797 identical to the human cDNA sequence D86987 submitted by Nagase et al. (52Nagase T. Seki N. Ishikawa K. Ohira M. Kawarabayasi Y. Ohara O. Tanaka A. Kotani H. Miyajima N. Nomura N. DNA Res. 1996; 3: 321-329Crossref PubMed Scopus (204) Google Scholar) to the GenBankTM and recently identified as mitofusin Mfn2 (22Santel A. Fuller M.T. J. Cell Sci. 2001; 114: 867-874Crossref PubMed Google Scholar). Multi-alignment of human Mfn2 with other gene products showed that it is 957 identical to the rat Mfn2 protein (U41308), 947 identical to the mouse Mfn2 counterpart (GenBankTMaccession number AY028170), and 477 identical to Drosophila melanogaster Mfn2 (GenBankTM accession numberAF355475). Lower identity was found with the fzo gene product from D. melanogaster (317 identity) (10Hales K.G. Fuller M.T. Cell. 1997; 90: 121-129Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (464) Google Scholar) and that from Saccharomyces cerevisiae (87 identity) (11Rapaport D. Brunner M. Neupert W. Westermann B. J. Biol. Chem. 1998; 273: 20150-20155Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (289) Google Scholar). The tissue distribution of human Mfn2 mRNA was examined by Northern blot analysis at high stringency (Fig.1A). The mRNA species of 4.7 kb hybridized with the 321-bp clone. Transcripts were predominant in skeletal muscle and heart, but expression was low in brain, kidney, and liver (Fig. 1A). A similar distribution profile was detected in rat tissues (data not shown). Based on the abundant expression of Mfn2 mRNA in skeletal muscle, we examined whether the expression was regulated during myogenesis. L6E9 myoblasts barely expressed Mfn2, but a marked induction of Mfn2 mRNA levels was detected with differentiation into myotubes (Fig.1B). A polyclonal antibody was raised against a Mfn2 sequence, which detected a 110-kDa band in extracts from heart, skeletal muscle, brown adipose tissue, and kidney in rats (Fig.2A); the band was specifically washed by an excess of the immunogenic peptide (Fig. 2A). Endogenous Mfn2 was enriched in mitochondrial fractions in heart, brown adipose tissue, and kidney (Fig. 2B), which is in keeping with observations that overexpressed Mfn2 is found in mitochondria (22Santel A. Fuller M.T. J. Cell Sci. 2001; 114: 867-874Crossref PubMed Google Scholar,34Rojo M. Legros F. Chateau D. Lombes A. J. Cell Sci. 2002; 115: 1663-1674Crossref PubMed Google Scholar). Under these conditions, we found that myogenesis caused the induction of Mfn2 protein in L6E9 cells (Fig. 2C). Induction of Mfn2 gene expression in L6E9 myotubes was parallel to the development of a very extensive mitochondrial network (Fig. 3, A and B). Evidence for the operation of the mitochondrial network as an intralumenally connected system in muscle cells was obtained by laser microirradiation (3Amchenkova A.A. Bakeeva L.E. Chentsov Y.S. Skulachev V.P. Zorov D.B. J. Cell Biol. 1988; 107: 481-495Crossref PubMed Scopus (220) Google Scholar). In myoblast cells, a short portion of a mitochondrial filament became de-energized when one of the cluster-composing mitochondria was damaged by laser (Fig. 3,C and D). As a consequence of the loss of mitochondrial membrane potential, mitochondria became unstained by JC-1. In contrast, illumination of a single mitochondrial filament in L6E9 myotubes caused a generalized loss of mitochondrial membrane potential throughout the mitochondrial network, and affecting areas situated far from the irradiation spot (see Fig. 6, A andB). These data indicate the existence of a very extensive intralumenal connectivity in the mitochondria that form the mitochondrial network in myotubes.Figure 6Mfn2 repression alters the operation of the mitochondrial network in muscle cells. Myotubes infected with the AS adenoviral vector (C and D) or with adenoviruses encoding औ-galactosidase (A and B) were irradiated with a laser beam to perforate mitochondria and to induce discharge of the membrane potential in the mitochondrial network. Pseudocolor images of the green fluorescence emitted by the monomers of JC-1 were taken before (A and C) and after 5 min (B and D) of laser irradiation. Total discharge of mitochondrial membrane potential is detected as destained of previously stained mitochondria. The arrows show the place of the laser illumination. The arrowheads show mitochondrial clusters unaffected after laser illumination in AS cells. The dotted lines delineate the myotubes. Scale bars, 10 ॖm.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) To determine the precise role of Mfn2 on the mitochondrial network, we performed studies in which Mfn2 expression was up- and down-regulated. Overexpression of Mfn2 after transient transfection collapsed the network in L6E9 myoblasts and mitochondria clustered around the nucleus (Fig. 4,A and B). Mitochondria in 10T1/2 fibroblasts are also usually organized in filaments but rarely seen as isolated organelles (Fig. 4C). Overexpression of Mfn2 after transient transfection also caused mitochondrial clustering around the nucleus (Fig. 4D). This is in keeping with recent observations (22Santel A. Fuller M.T. J. Cell Sci. 2001; 114: 867-874Crossref PubMed Google Scholar,34Rojo M. Legros F. Chateau D. Lombes A. J. Cell Sci. 2002; 115: 1663-1674Crossref PubMed Google Scholar). Transmission electron microscopy revealed that this clustering was not due to the generation of giant mitochondria. Instead, it corresponds to aggregates of mitochondria with normal ultrastructural morphology (Fig. 4, E and F). Both endogenous and overexpressed Mfn2 protein was localized in mitochondria by biochemical and immunofluorescence assays (data not shown). These data indicate that Mfn2 requires additional proteins to complete the full mitochondrial fusion process. To determine the impact of the repression of Mfn2 gene expression, we knocked down Mfn2 expression in muscle cells. To this end, we generated an adenoviral vector encoding a mouse Mfn2 antisense sequence (AS), and this was used to infect L6E9 myotubes. AS adenoviral infection reduced Mfn2 protein levels in mitochondrial extracts (by about 507) in the absence of alterations in the abundance of Porin (Fig.5A). This effect was specific, and infection with an irrelevant adenovirus, encoding औ-galactosidase, had no effect on Mfn2 expression (Fig.5A). Control myotubes or myotubes infected with an irrelevant adenovirus had an extensive mitochondrial network with large filaments running longitudinal to the muscle cell (Fig. 5, Band C). In contrast, AS muscle cells showed discontinuity of the mitochondrial network (Fig. 5D). Quantitation indicated that 827 of mitochondrial filaments were longer than 5 ॖm in control cells, whereas only 227 of the total mitochondrial filaments showed that size in AS cells. Illumination of mitochondria in AS myotubes was associated with a loss of mitochondrial membrane potential that affected a very reduced extension of the mitochondrial network (Fig.6, A and B) compared with control cells (Fig. 6, C and D), supporting the view for a fragmentation of the mitochondrial network into independent functional clusters. Next, we examined whether reduction in Mfn2 expression caused alterations in mitochondrial metabolism. Repression of Mfn2 expression mediated by AS adenoviral expression in L6E9 myotubes reduced glucose oxidation by 307 (Fig. 7A). This effect was specific, and infection with an adenoviral vector encoding औ-galactosidase did not alter glucose oxidation (Fig. 7A). One point of note is that not all L6E9 myoblasts are usually differentiated into myotubes in culture, and near 307 of myoblasts remain undifferentiated (35Canicio J. Gallardo E. Illa I. Testar X. Palacin M. Zorzano A. Kaliman P. Endocrinology. 1998; 139: 5042-5049Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar); provided that undifferentiated myoblasts are not infected with adenoviruses, the reduction we observe in glucose oxidation after AS adenoviral infection represents a substantial underestimate of the actual inhibition. In these conditions, Mfn2 repression reduced mitochondrial membrane potential (Fig.7B). We also stably transfected 10T1/2 cells with a mouse Mfn2 antisense sequence. Mfn2 mRNA and protein levels were lower in antisense clones than in untransfected or mock transfected cells (Mfn2 protein levels ranged from 32 to 677 of control values in AS clones) (Fig.8, A and B). Repression of Mfn2 in 10T1/2 cells also reduced glucose oxidation by 307 (Fig. 8C). In addition, AS cells showed a 307 reduction in oxygen consumption (Fig. 8D). In these conditions, coupled oxygen consumption was unaltered, whereas respiration linked to the mitochondrial proton leak was significantly reduced in AS cells (Fig. 8D). These data indicate that reduction of Mfn2 expression causes alterations in mitochondrial metabolism characterized by reduced cellular oxygen consumption and depressed glucose oxidation. Skeletal muscle in human obesity is characterized by metabolic alterations, including insulin resistance, accumulation of intracellular triglycerides, reduced oxidation processes, and impaired glucose-induced thermogenesis (36Astrup A. Andersen T. Henriksen O. Christensen N.J. Bulow J. Madsen J. Quaade F. Int. J. Obesity. 1987; 11: 51-66PubMed Google Scholar, 37Kelley D.E. Mandarino L.J. Diabetes. 2000; 49: 677-683Crossref PubMed Scopus (741) Google Scholar). In some animal models of obesity such as in obese Zucker rats or ob/ob mice, skeletal muscle shows a metabolic profile characterized by reduced glucose uptake and glucose oxidation, altered partitioning of fatty acids that are incorporated into triglycerides, or oxidized, insulin resistance and reduced oxygen consumption (38Cuendet G.S. Loten E.G. Jeanrenaud
0

Uncoupled and surviving: individual mice with high metabolism have greater mitochondrial uncoupling and live longer

John Speakman et al.May 6, 2004
Summary Two theories of how energy metabolism should be associated with longevity, both mediated via free‐radical production, make completely contrary predictions. The ‘rate of living‐free‐radical theory’ ( Pearl, 1928 ; Harman, 1956 ; Sohal, 2002 ) suggests a negative association, the ‘uncoupling to survive’ hypothesis ( Brand, 2000 ) suggests the correlation should be positive. Existing empirical data on this issue is contradictory and extremely confused ( Rubner, 1908 ; Yan & Sohal, 2000 ; Ragland & Sohal, 1975 ; Daan et al ., 1996 ; Wolf & Schmid‐Hempel, 1989 ]. We sought associations between longevity and individual variations in energy metabolism in a cohort of outbred mice. We found a positive association between metabolic intensity (kJ daily food assimilation expressed as g/body mass) and lifespan, but no relationships of lifespan to body mass, fat mass or lean body mass. Mice in the upper quartile of metabolic intensities had greater resting oxygen consumption by 17% and lived 36% longer than mice in the lowest intensity quartile. Mitochondria isolated from the skeletal muscle of mice in the upper quartile had higher proton conductance than mitochondria from mice from the lowest quartile. The higher conductance was caused by higher levels of endogenous activators of proton leak through the adenine nucleotide translocase and uncoupling protein‐3. Individuals with high metabolism were therefore more uncoupled, had greater resting and total daily energy expenditures and survived longest – supporting the ‘uncoupling to survive’ hypothesis.
0
Citation743
0
Save
0

Mitochondrial Complex II Can Generate Reactive Oxygen Species at High Rates in Both the Forward and Reverse Reactions

Casey Quinlan et al.Jun 12, 2012
Respiratory complex II oxidizes succinate to fumarate as part of the Krebs cycle and reduces ubiquinone in the electron transport chain. Previous experimental evidence suggested that complex II is not a significant contributor to the production of reactive oxygen species (ROS) in isolated mitochondria or intact cells unless mutated. However, we find that when complex I and complex III are inhibited and succinate concentration is low, complex II in rat skeletal muscle mitochondria can generate superoxide or H2O2 at high rates. These rates approach or exceed the maximum rates achieved by complex I or complex III. Complex II generates these ROS in both the forward reaction, with electrons supplied by succinate, and the reverse reaction, with electrons supplied from the reduced ubiquinone pool. ROS production in the reverse reaction is prevented by inhibition of complex II at either the ubiquinone-binding site (by atpenin A5) or the flavin (by malonate), whereas ROS production in the forward reaction is prevented by malonate but not by atpenin A5, showing that the ROS from complex II arises only from the flavin site (site IIF). We propose a mechanism for ROS production by complex II that relies upon the occupancy of the substrate oxidation site and the reduction state of the enzyme. We suggest that complex II may be an important contributor to physiological and pathological ROS production. Respiratory complex II oxidizes succinate to fumarate as part of the Krebs cycle and reduces ubiquinone in the electron transport chain. Previous experimental evidence suggested that complex II is not a significant contributor to the production of reactive oxygen species (ROS) in isolated mitochondria or intact cells unless mutated. However, we find that when complex I and complex III are inhibited and succinate concentration is low, complex II in rat skeletal muscle mitochondria can generate superoxide or H2O2 at high rates. These rates approach or exceed the maximum rates achieved by complex I or complex III. Complex II generates these ROS in both the forward reaction, with electrons supplied by succinate, and the reverse reaction, with electrons supplied from the reduced ubiquinone pool. ROS production in the reverse reaction is prevented by inhibition of complex II at either the ubiquinone-binding site (by atpenin A5) or the flavin (by malonate), whereas ROS production in the forward reaction is prevented by malonate but not by atpenin A5, showing that the ROS from complex II arises only from the flavin site (site IIF). We propose a mechanism for ROS production by complex II that relies upon the occupancy of the substrate oxidation site and the reduction state of the enzyme. We suggest that complex II may be an important contributor to physiological and pathological ROS production.
0
Paper
Citation587
0
Save
0

Sites of reactive oxygen species generation by mitochondria oxidizing different substrates

Casey Quinlan et al.Jan 1, 2013
Mitochondrial radical production is important in redox signaling, aging and disease, but the relative contributions of different production sites are poorly understood. We analyzed the rates of superoxide/H2O2 production from different defined sites in rat skeletal muscle mitochondria oxidizing a variety of conventional substrates in the absence of added inhibitors: succinate; glycerol 3-phosphate; palmitoylcarnitine plus carnitine; or glutamate plus malate. In all cases, the sum of the estimated rates accounted fully for the measured overall rates. There were two striking results. First, the overall rates differed by an order of magnitude between substrates. Second, the relative contribution of each site was very different with different substrates. During succinate oxidation, most of the superoxide production was from the site of quinone reduction in complex I (site IQ), with small contributions from the flavin site in complex I (site IF) and the quinol oxidation site in complex III (site IIIQo). However, with glutamate plus malate as substrate, site IQ made little or no contribution, and production was shared between site IF, site IIIQo and 2-oxoglutarate dehydrogenase. With palmitoylcarnitine as substrate, the flavin site in complex II (site IIF) was a major contributor (together with sites IF and IIIQo), and with glycerol 3-phosphate as substrate, five different sites all contributed, including glycerol 3-phosphate dehydrogenase. Thus, the relative and absolute contributions of specific sites to the production of reactive oxygen species in isolated mitochondria depend very strongly on the substrates being oxidized, and the same is likely true in cells and in vivo.
0
Paper
Citation518
0
Save
0

Inhibitors of the Quinone-binding Site Allow Rapid Superoxide Production from Mitochondrial NADH:Ubiquinone Oxidoreductase (Complex I)

Adrian Lambert et al.Jul 16, 2004
Neither the route of electron transport nor the sites or mechanism of superoxide production in mitochondrial complex I has been established. We examined the rates of superoxide generation (measured as hydrogen peroxide production) by rat skeletal muscle mitochondria under a variety of conditions. The rate of superoxide production by complex I during NADH-linked forward electron transport was less than 10% of that during succinate-linked reverse electron transport even when complex I was fully reduced by pyruvate plus malate in the presence of the complex III inhibitor, stigmatellin. This asymmetry was not explained by differences in protonmotive force or its components. However, when inhibitors of the quinone-binding site of complex I were added in the presence of ATP to generate a pH gradient, there was a rapid rate of superoxide production by forward electron transport that was as great as the rate seen with reverse electron transport at the same pH gradient. These observations suggest that quinone-binding site inhibitors can make complex I adopt the highly radical-producing state that occurs during reverse electron transport. Despite complete inhibition of NADH: ubiquinone oxidoreductase activity in each case, different classes of quinone-binding site inhibitor (rotenone, piericidin, and high concentrations of myxothiazol) gave different rates of superoxide production during forward electron transport (the rate with myxothiazol was twice that with rotenone) suggesting that the site of rapid superoxide generation by complex I is in the region of the ubisemiquinone-binding sites and not upstream at the flavin or low potential FeS centers. Neither the route of electron transport nor the sites or mechanism of superoxide production in mitochondrial complex I has been established. We examined the rates of superoxide generation (measured as hydrogen peroxide production) by rat skeletal muscle mitochondria under a variety of conditions. The rate of superoxide production by complex I during NADH-linked forward electron transport was less than 10% of that during succinate-linked reverse electron transport even when complex I was fully reduced by pyruvate plus malate in the presence of the complex III inhibitor, stigmatellin. This asymmetry was not explained by differences in protonmotive force or its components. However, when inhibitors of the quinone-binding site of complex I were added in the presence of ATP to generate a pH gradient, there was a rapid rate of superoxide production by forward electron transport that was as great as the rate seen with reverse electron transport at the same pH gradient. These observations suggest that quinone-binding site inhibitors can make complex I adopt the highly radical-producing state that occurs during reverse electron transport. Despite complete inhibition of NADH: ubiquinone oxidoreductase activity in each case, different classes of quinone-binding site inhibitor (rotenone, piericidin, and high concentrations of myxothiazol) gave different rates of superoxide production during forward electron transport (the rate with myxothiazol was twice that with rotenone) suggesting that the site of rapid superoxide generation by complex I is in the region of the ubisemiquinone-binding sites and not upstream at the flavin or low potential FeS centers. It is well established that the mitochondrial electron transport chain produces superoxide ( O2−˙), as the result of single electron leaks to oxygen during electron transport from reduced substrates to complex IV (1Turrens J.F. J. Physiol. (Lond.). 2003; 552: 335-344Crossref Scopus (3657) Google Scholar). Superoxide is converted into hydrogen peroxide by the action of manganese superoxide dismutase (SOD) 1The abbreviations used are: SOD, superoxide dismutase; ROS, reactive oxygen species; Q, ubiquinone; PHPA, p-hydroxyphenylacetic acid; TPMP, triphenylmethylphosphonium. in the mitochondrial matrix or by the action of copper/zinc SOD in the cytosol. If superoxide is not removed from the mitochondrial matrix, as in the case of manganese SOD nullizygous mice, severe pathologies arise, and the life-span is curtailed to about 10 days (2Li Y. Huang T.T. Carlson E.J. Melov S. Ursell P.C. Olson J.L. Noble L.J. Yoshimura M.P. Berger C. Chan P.H. Wallace D.C. Epstein C.J. Nat. Genet. 1995; 11: 376-381Crossref PubMed Scopus (1462) Google Scholar). If superoxide is not removed from the cytosol, as in the case of copper/zinc SOD nullizygous mice, the effects are not lethal, although an increase in sensitivity to oxidative stress is apparent (3Ho Y.S. Gargano M. Cao J. Bronson R.T. Heimler I. Hutz R.J. J. Biol. Chem. 1998; 273: 7765-7769Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (280) Google Scholar). Thus there is intense interest in superoxide and the other reactive oxygen species (ROS) it gives rise to (such as hydrogen peroxide and hydroxyl radical), as ROS clearly play a role in a variety of pathological disorders and perhaps aging (4Halliwell B. Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press Inc., New York1999Google Scholar, 5Cadenas E. Davies K.J. Free Radic. Biol. Med. 2000; 29: 222-230Crossref PubMed Scopus (2409) Google Scholar). The sites of superoxide production within the mitochondrial electron transport chain in vitro have been localized to complexes I and III (6Raha S. Robinson B.H. Trends Biochem. Sci. 2000; 25: 502-508Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (907) Google Scholar). Complex I produces superoxide to the matrix side of the mitochondrial membrane exclusively, whereas complex III appears to produce superoxide to both the matrix and intermembrane space in roughly equal amounts (7St-Pierre J. Buckingham J.A. Roebuck S.J. Brand M.D. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44784-44790Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1240) Google Scholar, 8Han D. Williams E. Cadenas E. Biochem. J. 2001; 353: 411-416Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar, 9Miwa S. St-Pierre J. Partridge L. Brand M.D. Free Radic. Biol. Med. 2003; 35: 938-948Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar). The relative importance of each complex to total superoxide production is debated; during reverse electron transport from succinate to NAD, complex I produces superoxide at very high rates (10Turrens J.F. Boveris A. Biochem. J. 1980; 191: 421-427Crossref PubMed Scopus (1367) Google Scholar, 11Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Crossref PubMed Scopus (987) Google Scholar, 12Kushnareva Y. Murphy A.N. Andreyev A. Biochem. J. 2002; 368: 545-553Crossref PubMed Scopus (548) Google Scholar, 13Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Crossref PubMed Scopus (398) Google Scholar, 14Votyakova T.V. Reynolds I.J. J. Neurochem. 2001; 79: 266-277Crossref PubMed Scopus (511) Google Scholar, 15Han D. Canali R. Rettori D. Kaplowitz N. Mol. Pharmacol. 2003; 64: 1136-1144Crossref PubMed Scopus (181) Google Scholar), but the physiological relevance of reverse electron transport in unclear. During forward electron transport, however (which is clearly physiological), both complexes produce superoxide at relatively low rates, unless inhibitors such as rotenone (for complex I) or antimycin A (for complex III) are present. Under these inhibited conditions with forward electron transport (which are not physiological) the superoxide production rates are relatively high. Whatever the relative importance of the complexes to total superoxide production in vivo, compared with complex III, very little is known about the mechanism of complex I superoxide production. In mitochondria, superoxide is produced by the single electron reduction of oxygen by an electron carrier within the electron transport chain. In complex III the electron carriers are cytochromes bL, bH and c1, the Rieske iron-sulfur center, and the semiquinones at centers “i” and “o.” The main reductant of oxygen to produce superoxide at complex III has been identified as the semiquinone at center o, consistent with the Q cycle mechanism of the complex (16Turrens J.F. Alexandre A. Lehninger A.L. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 237: 408-414Crossref PubMed Scopus (1073) Google Scholar). In complex I, the electron carriers are the flavin, the iron-sulfur centers N1a, N1b, N2, N3, N4, N5, and an unknown number of semiquinones (17Friedrich T. Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1364: 134-146Crossref PubMed Scopus (180) Google Scholar). The reductant of oxygen to produce superoxide in this enzyme is not known, and published reports are highly conflicting. On thermodynamic grounds, center N1a (12Kushnareva Y. Murphy A.N. Andreyev A. Biochem. J. 2002; 368: 545-553Crossref PubMed Scopus (548) Google Scholar) and the flavin (18Kudin A.P. Bimpong-Buta N.Y. Vielhaber S. Elger C.E. Kunz W.S. J. Biol. Chem. 2004; 279: 4127-4135Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (430) Google Scholar) were suggested as the main superoxide producing sites. Based on inhibitor studies, the flavin (11Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Crossref PubMed Scopus (987) Google Scholar, 19Young T.A. Cunningham C.C. Bailey S.M. Arch. Biochem. Biophys. 2002; 405: 65-72Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar), center N2 (20Genova M.L. Ventura B. Giuliano G. Bovina C. Formiggini G. Parenti Castelli G. Lenaz G. FEBS Lett. 2001; 505: 364-368Crossref PubMed Scopus (263) Google Scholar) and the iron-sulfur proteins and semiquinones in general (21Herrero A. Barja G. J. Bioenerg. Biomembr. 2000; 32: 609-615Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar) were suggested as sites of superoxide production. It is feasible that all these sites produce superoxide and that production rates by different sites are tissue or condition specific. We recently demonstrated that superoxide production rates by complex I during reverse electron transport are highly dependent on the pH gradient (ΔpH) across the mitochondrial inner membrane (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar). All previous studies of complex I ROS production used conditions in which the pH gradient was either zero or very low, so they probably missed the site of maximal superoxide production by the complex. It has been suggested that the main site of superoxide production within complex I is a semiquinone (6Raha S. Robinson B.H. Trends Biochem. Sci. 2000; 25: 502-508Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (907) Google Scholar). As stated above, superoxide production rates by complex I during reverse electron transfer are much greater than during forward electron transfer. By investigating this asymmetry, we have found conditions in which it is abolished. Our results suggest strongly that the major site of superoxide production in complex I is the quinone-binding site; it is most likely a semiquinone. Materials—Piericidin A was a kind gift from Dr. Mauro Degli Esposti (University of Manchester, UK). All other chemicals were purchased from Sigma. Measurement of Mitochondrial Superoxide Production—Mitochondria from skeletal muscle of female Wistar rats (aged between 5 and 8 weeks) were isolated by differential centrifugation as described (23Rolfe D.F.S. Hulbert A.J. Brand M.D. Biochim. Biophys. Acta. 1994; 1188: 405-416Crossref PubMed Scopus (226) Google Scholar). Superoxide production rate was assessed by measurement of hydrogen peroxide generation rate, determined fluorometrically by measurement of oxidation of p-hydroxyphenylacetic acid (PHPA) coupled to the enzymatic reduction of H2O2 by horseradish peroxidase. Mitochondria (0.35 mg of mitochondrial protein·ml–1) were incubated at 37 °C in standard buffer containing 120 mm KCl, 3 mm HEPES, 1 mm EGTA, 0.3% bovine serum albumin (w/v) (pH 7.2 at 37 °C). All incubations also contained 50 μg·ml–1 PHPA, 4 units·ml–1 horseradish peroxidase, 30 units·ml–1 superoxide dismutase (SOD), and 1.875 μm triphenylmethylphosphonium (TPMP+) bromide. The reaction was initiated by addition of respiratory substrates; after 1 min the increase in fluorescence at an excitation of 320 nm and emission of 400 nm was followed on a computer-controlled Shimadzu RF5301 spectrofluorometer for 2–3 min. Appropriate corrections for background signals were applied (7St-Pierre J. Buckingham J.A. Roebuck S.J. Brand M.D. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44784-44790Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1240) Google Scholar), and standard curves generated using known amounts of H2O2 were used to calculate the rate of H2O2 production in nmol·min–1·mg mitochondrial protein–1. Essentially all the superoxide from complex I is generated on the matrix side of the inner membrane and then converted by endogenous processes to H2O2, which leaks out and is measured in the assay (7St-Pierre J. Buckingham J.A. Roebuck S.J. Brand M.D. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44784-44790Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1240) Google Scholar). Certain compounds employed in the experiments (such as myxothiazol and ATP) caused significant quenching of the fluorescent signals; therefore careful calibration with standard curves generated for all conditions was essential to obtain the correct rates of H2O2 production. Measurement of Mitochondrial Protonmotive Force (Δp)—Mitochondrial membrane potential, Δψ, was determined using an electrode sensitive to TPMP+ as described (24Brand M.D. Brown G.C. Cooper C.E. Bioenergetics: A Practical Approach. IRL Press, Oxford1995: 39-62Google Scholar). Skeletal muscle mitochondria were incubated under the same conditions as for superoxide production at 37 °C in standard buffer with PHPA, horseradish peroxidase, and SOD. The electrode was calibrated by sequential 0.375 μm additions of TPMP+ up to 1.875 μm. The reaction was initiated by addition of respiratory substrate, and Δψ was measured upon reaching the steady state (∼1 min). The chemical component of protonmotive force, ΔpH, was then measured as the change in ΔΨ after ΔpH was converted to Δψ following addition of 100 nm nigericin. After each run, the uncoupler carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone was added to 2 μm to release the TPMP+ and allow correction for any small drift in the TPMP+ electrode. Potentials were calculated as described (24Brand M.D. Brown G.C. Cooper C.E. Bioenergetics: A Practical Approach. IRL Press, Oxford1995: 39-62Google Scholar), on the basis that Δp = Δψ + ΔpH (all in mV, giving positive signs to electrical potentials that were positive outside and pH gradients that were acid outside). Determination of NADH:Q2 Oxidoreductase Activity—Complex I activity was assessed by monitoring the disappearance of 25 μm NADH with 125 μm coenzyme Q2 as an electron acceptor. NADH was monitored fluorometrically at excitation and emission wavelengths of 365 and 450 nm, respectively, under identical incubation and buffer conditions to those used for measurement of H2O2 and Δp. To allow NADH to react with complex I, the mitochondria were broken open by three freeze-thaw cycles prior to assay. The concentrations of rotenone, piericidin, and myxothiazol required to achieve maximal inhibition of complex I were determined by titration. Statistics—Values are given as means ± S.E. with n being the number of separate mitochondrial preparations. The significance of differences between means was assessed by unpaired Student's t test; p values < 0.05 were taken to be significant. Comparison of Superoxide Production by Complex I during Forward and Reverse Electron Transport—A series of experiments (Fig. 1) was conducted to examine production of superoxide during forward and reverse electron transport by complex I. As shown in Fig. 1a, with pyruvate + malate as substrates, the rate of H2O2 production from the entire electron transport chain was low, only 0.03 nmol·min–1·mg protein–1. A similar rate was found for another combination of forward electron transport linked substrates: glutamate + malate (not shown). With succinate as substrate the rate of superoxide production was some 100-fold greater (Fig. 1a) and was localized almost entirely at complex I during reverse electron transport (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar). The high rate of superoxide production during reverse electron transport into complex I is very sensitive to the pH gradient across the inner mitochondrial membrane (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar), since conversion of ΔpH to Δψ by the addition of nigericin strongly inhibited superoxide production (Fig. 1a). There was no significant difference in ΔpH between mitochondria oxidising succinate and pyruvate + malate (Table I), so the differences in superoxide production between forward and reverse electron transport are not simply due to differences in ΔpH. Nigericin did not significantly alter superoxide production rate with pyruvate + malate (Fig. 1a), showing that with forward electron transport, ΔpH has no detectable effect on superoxide production rate under these conditions.Table IValues of ΔpH, Δψ, and Δp under various conditionsΔψΔpHΔpmVmVmVSuccinate141 ± 440 ± 5181 ± 5Pyruvate + malate143 ± 534 ± 4177 ± 5Pyruvate + malate + nigericin177 ± 5aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0177 ± 5Pyruvate + malate + rotenone0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.Pyruvate + malate + rotenone + ATP127 ± 622 ± 5149 ± 2Pyruvate + malate + piericidin0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.Pyruvate + malate + piericidin + ATP131 ± 413 ± 4aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.144 ± 2aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.Pyruvate + malate + myxothiazol0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.Pyruvate + malate + myxothiazol + ATP130 ± 1aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.11 ± 1aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.141 ± 5aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.Pyruvate + malate + stigmatellin0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.Pyruvate + malate + stigmatellin + ATP126 ± 5aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.25 ± 8151 ± 4aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.Pyruvate + malate + KCN0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.Pyruvate + malate + KCN + ATP137 ± 429 ± 1166 ± 3Pyruvate + malate + antimycin A0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.0 ± 0aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.Pyruvate + malate + antimycin A + ATP118 ± 5aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.25 ± 1144 ± 5aSignificant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate.a Significant (p < 0.05) difference from pyruvate + malate. Open table in a new tab It might be that the complex I superoxide-producing site is more reduced during reverse electron transport, when electrons are forced into the complex using the high Δp (and perhaps the high ubiquinone reduction state) generated by succinate oxidation, than it is during forward electron transport, when Δp may be a little lower (Table I) and when the ubiquinone pool may be more oxidized. To test this possibility, we added the complex I inhibitors rotenone, piericidin, or myxothiazol, to allow the complex to become fully reduced by electrons from pyruvate + malate. Myxothiazol is a center o inhibitor of complex III, but at high concentrations it is also an effective inhibitor of complex I (20Genova M.L. Ventura B. Giuliano G. Bovina C. Formiggini G. Parenti Castelli G. Lenaz G. FEBS Lett. 2001; 505: 364-368Crossref PubMed Scopus (263) Google Scholar, 25Degli Esposti M. Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1364: 222-235Crossref PubMed Scopus (458) Google Scholar). Addition of any one of these inhibitors did increase H2O2 production from pyruvate + malate, with myxothiazol having the largest effect, followed by piericidin then rotenone (Fig. 1b). The differences between inhibitors were not due to different levels of inhibition of complex I; Fig. 2 shows that superoxide production was near maximal for each inhibitor, and Fig. 3 shows that each caused maximal inhibition of NADH:Q2 oxidoreductase activity at the concentration used. However, even with myxothiazol, H2O2 production rates were still only one-third of those seen with reverse electron transport, so the reduction state of superoxide-generating sites upstream of the sites where these inhibitors work in complex I may contribute to the difference in superoxide production between reverse and forward electron transport but cannot fully explain it.Fig. 3Inhibition of complex I NADH:Q2 oxidoreductase activity by rotenone, piericidin, and myxothiazol. Incubation conditions are the same as those described for Fig. 1. Points represent means ± S.E. of measurements on three separate mitochondrial preparations. Top panel, rotenone, middle panel, piericidin; bottom panel, myxothiazol. Complex I activity was defined as 100% at zero inhibitor concentration.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) It may be that the main site of superoxide production from complex I is the Q-binding site itself. If so, then blocking this site with Q-type inhibitors (rotenone, piericidin, or high concentrations of myxothiazol) may inhibit superoxide production during forward electron transport, and the high rates seen with succinate cannot be achieved. To test this possibility, a condition is required in which the Q-binding site within complex I is fully reduced with forward electron transport but open (i.e. uninhibited). One way to achieve this condition would be to use a low concentration of myxothiazol, so that only center o of complex III is inhibited. The concentration of myxothiazol required to fully inhibit complex III in our system was 0.625 μm (not shown), but this concentration also inhibited complex I activity by about 40% (Fig. 3). Hence the Q-binding sites were not fully open at this relatively low myxothiazol concentration under the conditions employed. Another center o inhibitor of complex III is stigmatellin (26Degli Esposti M. Ghelli A. Crimi M. Estornell E. Fato R. Lenaz G. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993; 190: 1090-1096Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar), which at 80 nm did not inhibit complex I activity at all (not shown) but did inhibit complex III, as Δp was zero (Table I). We tested the effects of stigmatellin and two other different combinations of substrates and inhibitors that produce an open Q-binding site but reduced complex I during forward electron transport; the results are shown in Fig. 1c. The first other condition was pyruvate + malate plus potassium cyanide, which will cause maximal reduction of all complexes upstream of complex IV. The second other condition employed pyruvate + malate plus antimycin A (which gives complex I superoxide plus maximal superoxide production from complex III) minus the rate with succinate plus rotenone plus antimycin A (which gives maximal superoxide from complex III only). None of the three conditions tested caused the rate of superoxide production by complex I with forward electron transport to approach the rates seen with succinate alone. In the presence of stigmatellin, the rate of superoxide production was less than 10% of the rate during reverse electron transport with succinate seen in Fig. 1a. Therefore a fully reduced and open Q-binding site with forward electron transport is not sufficient to give high rates of superoxide production by complex I. The Effect of ΔpH on Superoxide Production during Forward Electron Transport—Under the conditions of pyruvate + malate + inhibitor shown in Fig. 1, ΔpH and Δψ are zero (Table I) because there is no proton pumping by the electron transport chain. As shown previously, H2O2 production by complex I is particularly sensitive to ΔpH during reverse electron transport (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar), so could the remaining difference in superoxide production rate between forward and reverse electron flow be caused by the lack of ΔpH during inhibited forward electron transport? The effects of ΔpH were tested using hydrolysis of added ATP to produce ΔpH and Δψ (Table I). As shown in Fig. 4a, ATP addition did elevate rates of H2O2 production with all three complex I inhibitors, and these increases were abolished by addition of nigericin, which brings ΔpH to zero while raising Δψ. In the presence of pyruvate + malate plus myxothiazol and ATP, ΔpH was about 10 mV (Table I), and the rate of H2O2 production was about 1.6 nmol·min–1·mg protein–1 (Fig. 4a), which is the same as the rate achieved by reverse electron transport from succinate at the same ΔpH (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar). The increases in H2O2 production seen upon addition of ATP were prevented when oligomycin was present in the medium (not shown), indicating that the effects of ATP were mediated by the ATPase. In support of these conclusions, we found that ATP hydrolysis could be replaced by succinate oxidation; the rate of H2O2 production was high when succinate was added in the presence of pyruvate + malate and either rotenone or piericidin (not shown). Experiments with pyruvate + malate plus either stigmatellin, KCN, or antimycin A with ATP are shown in Fig. 4b. It can be seen that imposition of a pH gradient did not permit generation of superoxide at high rates in the absence of Q site inhibitors. Therefore, a reduced, open Q-binding site in the presence of ΔpH during forward electron transport is not sufficient to generate the large amounts of superoxide seen during reverse electron transport. However, complex I with its Q-binding site inhibited by myxothiazol (or, to a lesser extent, by piericidin or rotenone) in the presence of ΔpH during forward electron transport is able to generate superoxide at the same rate as it does during reverse electron transport from succinate in the absence of any Q site inhibitor. The Effect of Matrix pH on Superoxide Production during Forward Electron Transport—Using the protocol previously described (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar), we checked that the strong inhibitory effect of nigericin on H2O2 production in the presence of pyruvate + malate, myxothiazol, and ATP (Fig. 4a) was not simply due to changes in internal pH (Fig. 5). At any internal pH, the rate of H2O2 production was greater in the absence of nigericin than in its presence. Thus, like superoxide generation during reverse electron transport, superoxide generation during forward electron transport under these conditions is dependent on ΔpH. In agreement with previous studies (10Turrens J.F. Boveris A. Biochem. J. 1980; 191: 421-427Crossref PubMed Scopus (1367) Google Scholar, 11Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Crossref PubMed Scopus (987) Google Scholar, 12Kushnareva Y. Murphy A.N. Andreyev A. Biochem. J. 2002; 368: 545-553Crossref PubMed Scopus (548) Google Scholar, 13Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Crossref PubMed Scopus (398) Google Scholar, 14Votyakova T.V. Reynolds I.J. J. Neurochem. 2001; 79: 266-277Crossref PubMed Scopus (511) Google Scholar, 15Han D. Canali R. Rettori D. Kaplowitz N. Mol. Pharmacol. 2003; 64: 1136-1144Crossref PubMed Scopus (181) Google Scholar), we show that superoxide production by complex I during reverse electron transport is huge compared with forward electron transport under similar conditions. This asymmetry of superoxide production by complex I has not previously been investigated in detail, and no mechanistic explanation of it has been offered in the literature. We characterized superoxide production by complex I and addressed two questions: under what conditions can complex I produce superoxide during forward electron transport at the high rates seen during reverse electron transport in intact mitochondria (in other words, can the asymmetry be explained), and which site in complex I generates the majority of the superoxide? Conditions of High Rates of Superoxide Production by Compex I—In terms of conditions, first, we demonstrate that a pH gradient across the mitochondrial inner membrane during forward (Figs. 4a and 5) or reverse (Fig. 1a and Ref. 22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar) electron transfer is required for high rates of superoxide production. The pH gradient can be generated by proton pumping by substrate oxidation (in the case of succinate) or by ATP hydrolysis via the ATPase (when the electron transport chain is inhibited). Second, we show that a relatively reduced complex I (as a whole) may be required but is not sufficient for high superoxide generation rates. During reverse electron transport an overall high reduction state is achieved by the high Δp forcing electrons from succinate into complex I. However, with forward electron transport, if a reduced complex I was sufficient for high superoxide production, then large rates would have been observed with pyruvate + malate plus stigmatellin, KCN, or ((antimycin A) minus (succinate + rotenone + antimycin A)). This was not the case; even when ATP was added to generate ΔpH, the superoxide production rates remained low under these conditions compared with the rates seen with succinate. Third, we have found that direct Q site inhibition is required for high rates of superoxide production by complex I during forward electron transport. Only in the presence of either rotenone, piericidin, or myxothiazol (and ΔpH) was the superoxide production rate high with forward electron transport (Fig. 4a). All three Q site inhibitors fully inhibited NADH:Q oxidoreductase activity, but myxothiazol was more effective at inducing superoxide production than piericidin, which in turn was more effective than rotenone. This situation appears analogous to the case with complex III. In its native (uninhibited) state, complex III produces superoxide at low rates, but in the presence of antimycin A the rate increases dramatically (7St-Pierre J. Buckingham J.A. Roebuck S.J. Brand M.D. J. Biol. Chem. 2002; 277: 44784-44790Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1240) Google Scholar, 11Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Crossref PubMed Scopus (987) Google Scholar, 13Hansford R.G. Hogue B.A. Mildaziene V. J. Bioenerg. Biomembr. 1997; 29: 89-95Crossref PubMed Scopus (398) Google Scholar, 15Han D. Canali R. Rettori D. Kaplowitz N. Mol. Pharmacol. 2003; 64: 1136-1144Crossref PubMed Scopus (181) Google Scholar). During forward electron transport, complex I produces superoxide at very low rates in its native state, but the rate can increase 10–30-fold in the presence of Q site inhibitors. Our findings are in good agreement with a previous report on superoxide production in heart submitochondrial particles (20Genova M.L. Ventura B. Giuliano G. Bovina C. Formiggini G. Parenti Castelli G. Lenaz G. FEBS Lett. 2001; 505: 364-368Crossref PubMed Scopus (263) Google Scholar). Using NADH to generate forward electron transport, a very low superoxide production rate was observed. This rate increased by about 3-fold when mucidin was used to block center o of complex III. However 10-fold increases in rate were seen in the presence of various complex I Q site inhibitors, and from our results it is likely these rates would have been even higher in the presence of ΔpH. Therefore, the conditions that explain the asymmetry of superoxide production between forward and reverse electron transport are very specific. The asymmetry is not simply due to differences in the overall redox state of complex I or differences in protonmotive force or its components. High rates of superoxide production, in the presence of ΔpH, were only achieved with the native enzyme during reverse electron transport (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar) or in the presence of Q site inhibitors during forward electron transport. The simplest explanation of these observations is that there is a particular state of complex I that leads to high superoxide production, and this state can be accessed either during reverse electron transport, or during forward electron transport when an inhibitor occupies the Q-binding site. The fact that different rates of superoxide production were obtained with the three different Q site inhibitors is consistent with the concept of two or three classes of complex I inhibitor with different degrees of overlap in a large Q-binding pocket (25Degli Esposti M. Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1364: 222-235Crossref PubMed Scopus (458) Google Scholar, 27Okun J.G. Lummen P. Brandt U. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2625-2630Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (298) Google Scholar). Occupation of one of these binding sites by an inhibitor would trigger superoxide production by promoting the reaction with oxygen of some reductant either within the Q site (such as a semiquinone) or elsewhere within complex I. Sites of Superoxide Production by Complex I—Which sites in complex I generate superoxide at high rates? If the main or only site of the high superoxide production we observe in the presence of ATP is upstream of the Q-binding site (i.e. from iron sulfur centers N1a, N1b, N3, N4, N5, or flavin), then, for a simple linear chain of electron carriers, addition of any Q site inhibitor should result in the same rate of superoxide production. This was not the case; we observed different increases (myxothiazol > piericidin > rotenone) in the rate of superoxide production from pyruvate + malate in both the absence (Fig. 1) and presence (Fig. 4a) of ATP. In addition, if sites upstream of Q generate superoxide, then the production rates from complex I should be similar with the Q site inhibitors and with stigmatellin, KCN, or antimycin A. This was clearly not the case (Fig. 4b). We conclude, therefore, that the sites upstream of Q must produce superoxide at low rates compared with the Q site itself, as illustrated in Fig. 6. Some reports (11Liu Y. Fiskum G. Schubert D. J. Neurochem. 2002; 80: 780-787Crossref PubMed Scopus (987) Google Scholar, 12Kushnareva Y. Murphy A.N. Andreyev A. Biochem. J. 2002; 368: 545-553Crossref PubMed Scopus (548) Google Scholar, 18Kudin A.P. Bimpong-Buta N.Y. Vielhaber S. Elger C.E. Kunz W.S. J. Biol. Chem. 2004; 279: 4127-4135Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (430) Google Scholar, 19Young T.A. Cunningham C.C. Bailey S.M. Arch. Biochem. Biophys. 2002; 405: 65-72Crossref PubMed Scopus (111) Google Scholar, 20Genova M.L. Ventura B. Giuliano G. Bovina C. Formiggini G. Parenti Castelli G. Lenaz G. FEBS Lett. 2001; 505: 364-368Crossref PubMed Scopus (263) Google Scholar) suggest that these upstream sites are mainly responsible for complex I superoxide production. It is difficult to compare the results from different laboratories, as the tissues used, methods of mitochondrial and submitochondrial particle isolation, ROS detection systems, buffer components, and correction for background signals all vary. However, one consistent factor appears to be that all of these previous studies used conditions in which ΔpH was either zero (the mitochondria or submitochondrial particles were deenergized) or low (e.g. due to the presence of phosphate in the medium (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar)). Therefore, superoxide production was probably not maximal in these studies, and they missed the site of high superoxide production discussed here. Their conclusions may be valid for the minor sites of superoxide production but would not be relevant to the major site of complex I superoxide production analyzed here. As discussed above, complex III only generates superoxide at high rates when antimycin A is present. This behavior is consistent with the Q cycle and is explained by the formation of a semiquinone at center o of the complex that reduces oxygen to superoxide (28Turrens J.F. Biosci. Rep. 1997; 17: 3-8Crossref PubMed Scopus (755) Google Scholar). By analogy, perhaps the requirement for Q site inhibitors for maximum superoxide production by complex I reflects Q cycle-type behavior in this complex too and suggests that the reductant of oxygen to produce superoxide is a semiquinone. The coupling mechanism of complex I remains unknown, but analogies to the Q cycle in complex III have been proposed (29Dutton P.L. Moser C.C. Sled V.D. Daldal F. Ohnishi T. Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1364: 245-257Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar). Other models have been suggested that are consistent with Q cycle-type behavior in the enzyme (30Brandt U. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1318: 79-91Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar). Where within the Q site could superoxide be produced? EPR studies have detected at least three ubisemiquinone species within complex I, termed SQNf, SQNs, and SQNx for fast relaxing, slow relaxing, and very slow relaxing semiquinone (31Yano T. Magnitsky S. Ohnishi T. Biochim. Biophys. Acta. 2000; 1459: 299-304Crossref PubMed Scopus (43) Google Scholar, 32Vinogradov A.D. Sled V.D. Burbaev D.S. Grivennikova V.G. Moroz I.A. Ohnishi T. FEBS Lett. 1995; 370: 83-87Crossref PubMed Scopus (109) Google Scholar, 33Magnitsky S. Toulokhonova L. Yano T. Sled V.D. Hagerhall C. Grivennikova V.G. Burbaev D.S. Vinogradov A.D. Ohnishi T. J. Bioenerg. Biomembr. 2002; 34: 193-208Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar). If there is a Q cycle mechanism in complex I, then as well as the canonical quinone reducing site there must be at least one additional quinone reduction and one quinol oxidation site. Recent models of complex I propose three different semiquinone sites: two quinone reduction sites and one quinol oxidation site (6Raha S. Robinson B.H. Trends Biochem. Sci. 2000; 25: 502-508Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (907) Google Scholar, 30Brandt U. Biochim. Biophys. Acta. 1997; 1318: 79-91Crossref PubMed Scopus (198) Google Scholar). Three classes of inhibitor have been described, possibly corresponding to three semiquinone species in a large Q-binding pocket (25Degli Esposti M. Biochim. Biophys. Acta. 1998; 1364: 222-235Crossref PubMed Scopus (458) Google Scholar, 27Okun J.G. Lummen P. Brandt U. J. Biol. Chem. 1999; 274: 2625-2630Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (298) Google Scholar). Of these species, only SQNf exhibits sensitivity to Δp. Since superoxide production is very sensitive to Δp, then SQNf might be the reductant of oxygen in complex I. If so, SQNf should exhibit high sensitivity to ΔpH. In addition, both rotenone and piericidin quench the SQNf radical, which would explain why they quench superoxide production from succinate. Fig. 7 displays a tentative model of superoxide production at the semiquinone in one of the Q reducing sites of complex I that is consistent with the observations presented here and previously (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar). Superoxide Production as a Tool to Investigate the Coupling Mechanism of Complex I—As discussed previously (22Lambert A.J. Brand M.D. Biochem. J. 2004; 382: 511-517Crossref PubMed Scopus (390) Google Scholar), one of the reasons why the coupling mechanism of complex I has remained elusive is the lack of easily studied intermediates. Superoxide production by complex I is an indirect measure of the redox status of a free radical intermediate in complex I and is fairly straightforward to measure. It is likely that this intermediate is a semiquinone and closely involved in the coupling reaction, as it is ΔpH-sensitive. We suggest, therefore, that superoxide production by complex I may be a useful tool to gain mechanistic insights into complex I. We thank Steven Roebuck, Helen Boysen, and Julie Buckingham for excellent technical assistance.
0

Superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) depends on the pH gradient across the mitochondrial inner membrane

Adrian Lambert et al.Aug 24, 2004
The relationship between protonmotive force and superoxide production by mitochondria is poorly understood. To address this issue, the rate of superoxide production from complex I of rat skeletal muscle mitochondria incubated under a variety of conditions was assessed. By far, the largest rate of superoxide production was from mitochondria respiring on succinate; this rate was almost abolished by rotenone or piericidin, indicating that superoxide production from complex I is large under conditions of reverse electron transport. The high rate of superoxide production by complex I could also be abolished by uncoupler, confirming that superoxide production is sensitive to protonmotive force. It was inhibited by nigericin, suggesting that it is more dependent on the pH gradient across the mitochondrial inner membrane than on the membrane potential. These effects were examined in detail, leading to the conclusions that the effect of protonmotive force was mostly direct, and not indirect through changes in the redox state of the ubiquinone pool, and that the production of superoxide by complex I during reverse electron transport was at least 3-fold more sensitive to the pH gradient than to the membrane potential.
Load More