Male subfertility or infertility is a common condition often characterized by men producing a low number of sperm with poor quality. To gain insight into this condition, we performed a quantitative proteomic analysis of semen samples obtained from infertile and fertile men. At least 6 proteins showed significant differences in regulation of alternatively spliced isoforms. To investigate this link between aberrant alternative splicing and production of poor-quality spermatozoa, we overexpressed the hnrnpH/F-orthologue Glorund (Glo) in

The family of CDC2-like kinases (CLKs) play a crucial role in regulating alternative splicing (AS), a process fundamental to eukaryotic gene expression and adaptation. Of particular interest, these enzymes exhibit unique responsiveness to minor temperature shifts, enabling them to modulate AS accordingly. Dysregulated CLK expression is linked to a wide variety of human diseases, establishing them as promising therapeutic targets. Despite the importance of CLKs, limited research has explored the genetic and functional diversification of this gene family. This report investigates the evolutionary origins, diversification, and functional implications of CLKs across major eukaryotic lineages through phylogenetic and structural comparisons. Our data demonstrate these kinases are prevalent throughout eukaryotes, with the original gene (which shares orthology to human CLK2), dating back to the Last Eukaryotic Common Ancestor. We identified three key duplication events in vertebrates, highlighting how this gene family has expanded and diversified in complex metazoans. Despite two instances of CLK paralog loss in vertebrate lineages, CLKs remain prevalent throughout metazoans, suggesting they are essential for complex eukaryotic life. Structural comparisons across diverse eukaryotes demonstrate kinase domain conservation, which is in line with their maintained function in AS regulation. While the N-terminal region of CLK family members varies significantly in amino acid sequence, the function of this domain to regulate phosphorylation of AS factors is conserved, albeit in a species-specific manner. CLKs exhibit unique thermo-sensitive properties across diverse species, challenging conventional enzymatic behaviour. This temperature regulation, mediated by their kinase activation segment, is characterised by increased activity at lower physiological temperatures. The conservation of this structure, and a thermo-sensitive amino acid motif within it, suggests this was an ancient adaptation for responding to environmental cues. Species-specific temperature profiles highlight the adaptive evolution of CLKs, enabling organisms to thrive in diverse environmental conditions including extreme temperatures. Our analysis expands the understanding of CLK biology across diverse eukaryotes and connects insights from model organisms to human biology.

Abstract After ejaculation, mammalian spermatozoa must undergo a process known as capacitation in order to successfully fertilize the oocyte. Several post-translational modifications occur during capacitation, including sialylation, which despite being limited to a few proteins, seems to be essential for proper sperm-oocyte interaction. Regardless of its importance, to date, no single study has ever identified nor quantified which glycoproteins bearing terminal sialic acid (Sia) are altered during capacitation. Here we characterize sialylation during mouse sperm capacitation. Using tandem mass spectrometry coupled with liquid chromatography (LC-MS/MS), we found 142 non-reductant peptides, with 9 of them showing potential modifications on their sialylated oligosaccharides during capacitation. As such, N-linked sialoglycopeptides from C4b-binding protein, endothelial lipase (EL), serine proteases 39 and 52, testis-expressed protein 101 and zonadhesin were reduced following capacitation. In contrast, mitochondrial aconitate hydratase (aconitase; ACO2) was the only protein to show an increase in Sia content during capacitation. Interestingly, while the loss of Sia within EL (N62) was accompanied by a reduction in its phospholipase A 1 activity, the increase of sialylation in the ACO2 (N612) also resulted in a decrease of the activity of this TCA cycle enzyme. The latter was confirmed by N612D recombinant protein with both His and GFP tag, in which the N612D mutant had no activity compared to WT when protein. Computer modelling show that N612 sits atop the catalytic site of ACO2. The introduction of sialic acid causes a large confirmation change in the alpha helix, essentially, distorting the active site, leading to complete loss of function. These findings suggest that the switch from oxidative phosphorylation, over to glycolysis that occurs during capacitation may come about through sialylation of ACO2.