Recent studies by our group and others demonstrated a required and conserved role of Stim in store-operated Ca 2+ influx and Ca 2+ release-activated Ca 2+ (CRAC) channel activity. By using an unbiased genome-wide RNA interference screen in Drosophila S2 cells, we now identify 75 hits that strongly inhibited Ca 2+ influx upon store emptying by thapsigargin. Among these hits are 11 predicted transmembrane proteins, including Stim , and one, olf186-F , that upon RNA interference-mediated knockdown exhibited a profound reduction of thapsigargin-evoked Ca 2+ entry and CRAC current, and upon overexpression a 3-fold augmentation of CRAC current. CRAC currents were further increased to 8-fold higher than control and developed more rapidly when olf186-F was cotransfected with Stim . olf186-F is a member of a highly conserved family of four-transmembrane spanning proteins with homologs from Caenorhabditis elegans to human. The endoplasmic reticulum (ER) Ca 2+ pump sarco-/ER calcium ATPase (SERCA) and the single transmembrane-soluble N -ethylmaleimide-sensitive (NSF) attachment receptor (SNARE) protein Syntaxin5 also were required for CRAC channel activity, consistent with a signaling pathway in which Stim senses Ca 2+ depletion within the ER, translocates to the plasma membrane, and interacts with olf186-F to trigger CRAC channel activity.

Ca(2+)-release-activated Ca(2+) (CRAC) channels underlie sustained Ca(2+) signalling in lymphocytes and numerous other cells after Ca(2+) liberation from the endoplasmic reticulum (ER). RNA interference screening approaches identified two proteins, Stim and Orai, that together form the molecular basis for CRAC channel activity. Stim senses depletion of the ER Ca(2+) store and physically relays this information by translocating from the ER to junctions adjacent to the plasma membrane, and Orai embodies the pore of the plasma membrane calcium channel. A close interaction between Stim and Orai, identified by co-immunoprecipitation and by Förster resonance energy transfer, is involved in the opening of the Ca(2+) channel formed by Orai subunits. Most ion channels are multimers of pore-forming subunits surrounding a central channel, which are preassembled in the ER and transported in their final stoichiometry to the plasma membrane. Here we show, by biochemical analysis after cross-linking in cell lysates and intact cells and by using non-denaturing gel electrophoresis without cross-linking, that Orai is predominantly a dimer in the plasma membrane under resting conditions. Moreover, single-molecule imaging of green fluorescent protein (GFP)-tagged Orai expressed in Xenopus oocytes showed predominantly two-step photobleaching, again consistent with a dimeric basal state. In contrast, co-expression of GFP-tagged Orai with the carboxy terminus of Stim as a cytosolic protein to activate the Orai channel without inducing Ca(2+) store depletion or clustering of Orai into punctae yielded mostly four-step photobleaching, consistent with a tetrameric stoichiometry of the active Orai channel. Interaction with the C terminus of Stim thus induces Orai dimers to dimerize, forming tetramers that constitute the Ca(2+)-selective pore. This represents a new mechanism in which assembly and activation of the functional ion channel are mediated by the same triggering molecule.

Abstract Anomalies in constitutive calcium entry (CCE) have been commonly attributed to cell dysfunction in pathological conditions such as cancer. Calcium influxes of this type rely on channels, such as TRP, to be constitutively opened and strongly depend on membrane potential and calcium driving force. We developed an optogenetic approach based on expression of the halorhodopsin chloride pump to study CCE in non-excitable cells. Using C2C12 cells, we found that halorhodopsin can be used to achieve a finely-tuned control of membrane polarization. Escalating the membrane polarization by incremental changes in light led to a concomitant increase in CCE through TRPV2 channels. Moreover, light-induced calcium entry through TRPV2 channels promoted cell migration. Our study shows for the first time that by modulating CCE and related physiological responses such as cell motility, halorhodopsin serves as a potentially powerful tool that could open new avenues for the study of CCE and associated cellular behaviors.

ABSTRACT Discovery of therapeutic targets against metastasis is of primary importance since being the main cause of cancer-related death. Melanoma is a highly aggressive cancer endowed with a unique capacity of rapidly metastasizing. Deregulation of calcium homeostasis has been involved in numerous cellular metastatic behaviors, although the molecular determinants supporting these processes often remain unclear. Here, we evidenced a prominent expression of the plasma membrane TRPV2 calcium channel as a distinctive feature of melanoma tumors, directly related to melanoma metastatic progression and dissemination. In vitro as well as in vivo , TRPV2 activity was sufficient to confer both migratory and invasive phenotypes to non-invasive melanoma cells, while conversely upon TRPV2 silencing, highly metastatic melanoma cells failed to retain their malignant behaviors. We established a model whereupon activation of the mechanosensitive TRPV2 channel, localized in highly dynamic nascent adhesion clusters, directly regulates calpain-dependent cleavage of the adhesive protein talin together with F-actin network. By operating at the crossroad of the tumor microenvironment and the intracellular machinery, mechanosensitive TRPV2 channel controls melanoma cells aggressiveness. Finally in human melanoma tumor samples, TRPV2 overexpression represents a molecular marker of advanced malignancy and bad prognosis, highlighting a new therapeutic option for migrastatics in the treatment of metastatic melanoma. Significance One essential feature of metastatic cells is enhanced motility and invasiveness. This study evidences TRPV2 channel control over metastatic melanoma invasiveness, highlights new migration regulatory mechanisms, and reveals this channel as a biomarker and migrastatic target for the treatment of advanced melanoma.