Using untargeted metabolomics (n = 1,162 subjects), the plasma metabolite (m/z = 265.1188) phenylacetylglutamine (PAGln) was discovered and then shown in an independent cohort (n = 4,000 subjects) to be associated with cardiovascular disease (CVD) and incident major adverse cardiovascular events (myocardial infarction, stroke, or death). A gut microbiota-derived metabolite, PAGln, was shown to enhance platelet activation-related phenotypes and thrombosis potential in whole blood, isolated platelets, and animal models of arterial injury. Functional and genetic engineering studies with human commensals, coupled with microbial colonization of germ-free mice, showed the microbial porA gene facilitates dietary phenylalanine conversion into phenylacetic acid, with subsequent host generation of PAGln and phenylacetylglycine (PAGly) fostering platelet responsiveness and thrombosis potential. Both gain- and loss-of-function studies employing genetic and pharmacological tools reveal PAGln mediates cellular events through G-protein coupled receptors, including α2A, α2B, and β2-adrenergic receptors. PAGln thus represents a new CVD-promoting gut microbiota-dependent metabolite that signals via adrenergic receptors.Video AbstracteyJraWQiOiI4ZjUxYWNhY2IzYjhiNjNlNzFlYmIzYWFmYTU5NmZmYyIsImFsZyI6IlJTMjU2In0.eyJzdWIiOiI1Y2Q0ZGZhMTNjOWZjODc1ZmQwODJkN2ZhMGZjY2M4OSIsImtpZCI6IjhmNTFhY2FjYjNiOGI2M2U3MWViYjNhYWZhNTk2ZmZjIiwiZXhwIjoxNjc4NTMyOTIxfQ.A7ok2qU77Vr0vgq8j1GPEn0w0uDprE84fuTG3Odr3YHzobK5z0XznViS5PD96VB3Dg1F02Gv-jBxQH-IXc8fryspRQcWNm2KBxypipWF8UeKgaKtAZfye0cRomFeYI5_Iza4mBs9260GDGX112uiizfXMLf_IQV742wepwhstcvKhiq9f2ovi9mQArvBrCO1TWP_-dAEEJO2FElitNSRqkmvZoRQJHwiANR-XGDBdqjQ3ogtfKipDUdkSYz0-BZT29l1rCYWxFY_0S1QDnxc0CZVjuhacEiFOWfmCVZVBIETFqZFE3xtqoqmPQqW80ki4DBLK5KB6xG7plHLvP9i2w(mp4, (36.03 MB) Download video

Significance Loss of skeletal muscle mass, or sarcopenia, is nearly universal in cirrhosis and adversely affects the outcome of these patients. There are no established therapies to prevent or reverse sarcopenia because the mechanisms are not known. We show that the expression of myostatin, a negative regulator of skeletal muscle mass, is increased in the cirrhotic muscle and is mediated by increased ammonia concentration. Skeletal muscle ammonia concentrations are significantly increased in cirrhosis, resulting in activation of the transcription factor NF-κB, which in turn increases the expression of myostatin. Given the high prevalence of cirrhosis, these studies are of broad general interest because ammonia-lowering strategies, NF-κB antagonists, and myostatin blocker are potential therapies to reverse sarcopenia of cirrhosis.

Abstract Ischemia/hypoxia is major underlying cause for heart failure and stroke. Although beta-adrenergic receptor (βAR) is phosphorylated in response to hypoxia, less is known about the underlying mechanisms. Hypoxia results in robust GRK2-mediated β2AR phosphorylation but does not cause receptor internalization. However, hypoxia leads to significant endosomal-β2AR phosphorylation accompanied by inhibition of β2AR-associated protein phosphatase 2A (PP2A) activity impairing resensitization. Phosphoinositide 3-kinase γ (PI3Kγ) impedes resensitization by phosphorylating endogenous inhibitor of protein phosphatase 2A, I2PP2A that inhibits PP2A activity. Hypoxia increased PI3Kγ activity leading to significant phosphorylation of I2PP2A resulting in inhibition of PP2A and consequently resensitization. Surprisingly, β-blocker abrogated hypoxia-mediated β2AR phosphorylation instead of phosphorylation in normoxia. Subjecting mice to hypoxia leads to significant cardiac dysfunction and β2AR phosphorylation showing conservation of non-canonical hypoxia-mediated pathway in vivo. These findings provide mechanistic insights on hypoxia-mediated βAR dysfunction which is rescued by β-blocker and will have significant implications in heart failure and stroke.

Abstract Insulin impairs β2-adrenergic receptor (β2AR) function through G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) by phosphorylation but less is known about dephosphorylation mechanisms mediated by protein phosphatase 2A (PP2A). Pharmacologic or genetic inhibition of phosphoinositide 3-kinase γ (PI3Kγ) unexpectedly resulted in significant reduction of insulin-mediated β2AR phosphorylation. Interestingly, β2AR-associated phosphatase activity was inhibited by insulin but was reversed by knock-down of PI3Kγ showing negative regulation of PP2A by PI3Kγ. Co-immunoprecipitation and surface plasmon resonance studies using purified proteins showed that GRK2 and PI3Kγ form a complex and could be recruited to β2ARs as GRK2 interacts with insulin receptor substrate following insulin treatment. Consistently, β-blocker pretreatment did not reduce insulin-mediated β2AR phosphorylation indicating agonist- and Gβγ-independent non-canonical regulation of receptor function. Mechanistically, PI3Kγ inhibits PP2A activity at the βAR complex by phosphorylating an intracellular inhibitor of PP2A (I2PP2A). Knock-down or CRISPR ablation of endogenous I2PP2A unlocked PP2A inhibition mediating β2AR dephosphorylation showing an unappreciated acute regulation of PP2A in mediating insulin-β2AR cross-talk. Summary Insulin impairs β2-adrenergic receptor (β2AR) function through G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2). We show that insulin simultaneously inhibits protein phosphatase 2A (PP2A) sustaining β2AR functional impairment. Unexpectedly, releasing PP2A inhibition by PI3Kγ preserves β2AR function despite intact insulin-driven GRK2-mechanisms.

ABSTRACT Autoantibodies recognizing human β1ARs generated due to dysregulation in autoimmune response are generally associated with deleterious cardiac outcomes. However, cellular studies show that isolates of β1AR autoantibody from patients differentially modulate β1AR function. β1AR autoantibodies belong to the IgG class of immunoglobulins, however it is not known whether the IgG sub-classes mediate variability in β1AR responses. To determine whether the IgG3 subclass of β1AR autoantibodies uniquely modulate β1AR function, HEK293 cells stably expressing human β1ARs were utilized. Treatment of cells with IgG3(-) serum resulted in significant increase of cAMP compared to IgG3(+) serum. Pre-treatment of cells with IgG3(+) serum impaired dobutamine-mediated Adenylate Cyclase (AC) activity and cAMP generation whereas, it surprisingly increased AC activity and cAMP generation with β-blocker metoprolol. Consistently, purified IgG3(+) β1AR autoantibodies impaired dobutamine-mediated cAMP while elevating metoprolol-mediated AC activity and cAMP. Despite IgG3(+) autoantibodies reducing cAMP response to dobutamine, they mediate significant ERK activation upon dobutamine. IgG3(+) β1AR autoantibodies did not alter β2AR function, reflecting their specificity. The study shows that IgG3(+) β1AR autoantibody impairs agonist-mediated G-protein coupling while preferentially mediating G-protein-independent ERK activation. Furthermore, it uniquely biases β-blocker towards G-protein coupling. This unique biasing capabilities of IgG3(+) β1AR autoantibodies may underlie the beneficial outcomes in patients.

Abstract Rationale Genetic deletion of Phosphoinositide 3-kinase (PI3Kγ) in mice (PI3Kγ −/− ) results in increased cAMP levels and enhanced ventricular rate/contractility. Whether PI3Kγ plays a role in cardiac contractility by altering intracellular calcium recycling is not known. Objective To understand the mechanism of PI3Kγ mediated regulation of cardiac contractility. Methods and Results Caffeine treatment of adult cardiomyocytes from PI3Kγ −/− mice showed significantly reduced calcium reuptake by sarcoendoplasmic reticulum (SR) indicating that PI3Kγ locally regulates SR function. This resulted in elevated levels of intracellular calcium for prolonged period following caffeine. Our findings show that delayed re-uptake of calcium was caused by changes in phosphorylation of phospholamban (PLN), a major regulator of SR calcium reuptake. PI3Kγ −/− cardiomyocytes show significantly reduced PLN phosphorylation due to increase in PLN-associated protein phosphatase (PP) activity as reflected by decreased demethylated-PP2A. Consistently, the altered calcium regulation in the cardiomyocytes of PI3Kγ −/− can be restored by inhibition of PP by okadaic acid. Unexpectedly, cardiomyocyate-specific overexpression of kinase-dead PI3Kγ PI3Kγ inact ) in the global PI3Kγ −/− cardiomyocytes normalized caffeine induced calcium reuptake, restored PLN phosphorylation, and decreased PLN-associated PP activity reflected by increased demethylated-PP2A. Conclusions These studies bring-to-fore an unrecognized regulation of PLN by PI3Kγ through PP2A with implications in deleterious cardiac remodeling as PI3Kγ is significantly upregulated following cardiac stress.